【摘要】：研究目的:1.研究Bcl-2家族抑制劑Sabutoclax(Sab)對于多種人類乳腺癌敏感細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系的殺傷作用,探討Sab對于乳腺癌耐藥細(xì)胞的抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。2.研究Sab對耐藥乳腺癌干細(xì)胞的殺傷作用,進(jìn)一步探索Sab克服乳腺癌耐藥的作用機(jī)制。3.泛Bcl-2家族抑制劑Sab聯(lián)合常規(guī)化療藥物多柔比星(DOX)/依托泊苷(VP-16),研究聯(lián)合用藥對于乳腺癌化療耐藥細(xì)胞的協(xié)同抑制作用。研究方法:1.使用細(xì)胞增殖實驗(MTT)方法,比較Sab及多種傳統(tǒng)化療藥物對化療敏感的乳腺癌細(xì)胞系及其相對應(yīng)的耐藥細(xì)胞系之間的藥物敏感性差異;通過平板克隆形成實驗,評價Sab對乳腺癌敏感細(xì)胞系MCF-7及Cal51和多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/A02及CALDOX的長效敏感性差異。2.通過Annexin V/PI染色法檢測Sab和依托泊苷對敏感及耐藥乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用;利用Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法檢測Sab對耐藥乳腺癌細(xì)胞早期凋亡的誘導(dǎo)作用;使用實時定量PCR法檢測耐藥細(xì)胞系中Sab處理前后凋亡通路相關(guān)基因的m RNA水平變化;采用Western blotting檢測不同細(xì)胞系中抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性及Sab處理后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變,誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡的IL-6/STAT3信號通路活性變化。3.采用實時定量PCR法檢測耐藥細(xì)胞系在Sab處理前后干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物m RNA水平變化;采用流式細(xì)胞儀檢測Sab處理前后乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/A02和CALDOX中干樣細(xì)胞CD44+/CD24-及ALDH+比例變化。4.利用球囊培養(yǎng)技術(shù)與軟瓊脂克隆形成實驗檢測耐藥細(xì)胞系MCF-7/A02和CALDOX經(jīng)Sab處理后,干細(xì)胞比例與增殖能力變化。5.采用免疫組化方法檢測乳腺癌患者腫瘤組織離體后,在體外經(jīng)Sab處理后,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性及相關(guān)凋亡蛋白的改變。6.利用MTT方法檢測Sab聯(lián)合多柔比星/依托泊苷對乳腺癌耐藥細(xì)胞系的作用,運(yùn)用Calcusyn軟件,計算藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)以明確雙藥聯(lián)合是否均有協(xié)同增效作用;通過平板克隆形成實驗,評價Sab聯(lián)合多柔比星對乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/A02及CALDOX的協(xié)同抑制作用。通過Annexin V/PI染色法檢測Sab聯(lián)合VP16對耐藥乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果:1.以乳腺癌敏感細(xì)胞系MCF-7和Cal51以及相對應(yīng)耐藥細(xì)胞系MCF-7/A02和CALDOX為研究對象,MTT實驗結(jié)果顯示Sab對于敏感及耐藥細(xì)胞系均具有明顯抑制作用,且抑制作用呈濃度依賴性。耐藥指數(shù)僅為1.6~3.3之間,而多柔比星等常規(guī)細(xì)胞毒性化療藥物的耐藥指數(shù)約40~60,遠(yuǎn)高于Sab。平板克隆形成實驗結(jié)果表明,多柔比星對于耐藥細(xì)胞抑制作用較差,而Sab對于上述4種細(xì)胞均具有長效抑制作用,可有效抑制耐藥細(xì)胞的增殖能力。2.通過Annexin V/PI染色法檢測顯示細(xì)胞毒性化療藥物依托泊苷可誘導(dǎo)乳腺癌敏感細(xì)胞凋亡,而相同劑量下耐藥細(xì)胞系則表現(xiàn)為耐受,凋亡變化不顯著。相同劑量Sab對乳腺癌敏感及耐藥細(xì)胞系均具有誘導(dǎo)凋亡作用。Caspase-3/7活性檢測以及Caspase-9檢測法表明小于半數(shù)抑制率劑量的Sab即可誘導(dǎo)乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡并呈濃度依賴性。PCR結(jié)果顯示在m RNA水平上,凋亡相關(guān)基因Bim和Bax的m RNA水平明顯升高,Sab高劑量組降低更明顯,survivin的m RNA水平明顯下降;Western blotting結(jié)果顯示在蛋白水平,Bim、Bax,PUMA表達(dá)水平升高,survivin表達(dá)下降。免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)Sab處理后,凋亡相關(guān)指標(biāo)survivin表達(dá)水平下降,而Bax表達(dá)水平升高。3.PCR結(jié)果顯示在m RNA水平上,CD44,ALDH和ABCG2表達(dá)水平顯著下降,CD24的m RNA水平未見明顯變化。乳腺癌細(xì)胞系干細(xì)胞亞群分析發(fā)現(xiàn),相較于乳腺癌敏感細(xì)胞,耐藥細(xì)胞系MCF-7/A02和CALDOX中CD44+/CD24-及ALDH+細(xì)胞的比例明顯增高。給予耐藥細(xì)胞系Sab處理后,CD44+/CD24-及ALDH+細(xì)胞的比例下降,并呈劑量依賴性。免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)Sab處理后,干細(xì)胞標(biāo)志物CD44及ALDH表達(dá)水平下降,p AKT及p STAT3經(jīng)Sab處理后表達(dá)水平下降,即IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性受抑制。4.懸浮細(xì)胞球囊培養(yǎng)和軟瓊脂克隆實驗證實耐藥細(xì)胞球囊形成能力及體外成瘤能力較敏感細(xì)胞更高,Sab對MCF-7/A02和CALDOX細(xì)胞系干細(xì)胞體外成瘤能力和球囊形成能力均有抑制作用,亦呈劑量依賴性。5.通過Sab聯(lián)合化療藥物在乳腺癌耐藥細(xì)胞系中的作用研究中提示,Sab聯(lián)合多柔比星/依托泊苷對乳腺癌耐藥細(xì)胞系具有協(xié)同增效作用。結(jié)論:1.Sab可有效抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞生長增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。2.Sab增加促凋亡蛋白Bax和Bim表達(dá),降低抗凋亡蛋白survivin表達(dá)進(jìn)而實現(xiàn)其促進(jìn)凋亡影響乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥的功能。3.Sab可有效抑制耐藥細(xì)胞系中乳腺癌干細(xì)胞的比例,從而抑制耐藥細(xì)胞的增殖以及成瘤能力。4.Bcl-2家族抑制劑Sab可以克服腫瘤細(xì)胞耐藥,與常規(guī)細(xì)胞毒性化療藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效作用。
【圖文】：

圖 1.2 Sab 和 DOX 對乳腺癌敏感和耐藥細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用1.2.2 Sab 誘導(dǎo)乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡首先我們利用Annexin V/PI染色法檢測Sab對乳腺癌耐藥細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示敏感細(xì)胞 MCF-7 和耐藥細(xì)胞 MCF-7/A02 在接受相同劑量依托泊苷40μM 處理后，MCF-7 細(xì)胞凋亡明顯，凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的 63.3%，而MCF-7/A02 細(xì)胞僅占 17.9%；Cal51 和 CALDOX 接受依托泊苷 10μM 處理后凋亡細(xì)胞分別為 26.6%和 5.7%（圖 1.3.1）�？梢姡劳胁窜湛梢哉T導(dǎo)敏感乳腺癌細(xì)胞凋亡，而對耐藥細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用較低。不同的是 MCF-7 和 MCF-7/A02 細(xì)胞給予 Sab 10μM 處理 24 小時后，凋亡細(xì)胞比例分別占 25.8%和 18.3%，可見對于敏感及耐藥細(xì)胞均具有抑制作用。Cal51 和 CALDOX 接受 Sab 5μM 處理后，凋亡細(xì)胞分別占 23.4%和 20.4%�？傊琒ab 可以誘導(dǎo)乳腺癌敏感和耐藥細(xì)胞凋亡，與傳統(tǒng)化療藥物相比，對耐藥細(xì)胞較為敏感（圖 1.3.1）。

圖 1.3.1 Sab 及依托泊苷對乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用為了進(jìn)一步驗證 Annexin V/PI 染色法結(jié)果，我們在耐藥細(xì)胞中進(jìn)行 caspase3/7 活性和 caspase 9 活性的檢測。結(jié)果顯示，給予不同濃度 Sab 處理耐藥細(xì)胞MCF-7/A02 和 CALDOX 后，，caspase 3/7 活性和 caspase 9 活性增加，且隨著劑量增加活性增強(qiáng)。caspase 3/7和caspase 9活性檢測進(jìn)一步驗證了Sab通過caspase途徑誘導(dǎo)乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡（圖 1.3.2）。圖 1.3.2 Sab 對乳腺癌耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的 caspase 活性影響1.2.3 Sab 可阻斷凋亡信號通路誘導(dǎo)乳腺癌耐藥細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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