【摘要】：世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計表明,乳腺癌是嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤,平均每8位成年女性中就有一位罹患乳腺癌,乳腺癌的發(fā)病率和致死率在女性惡性腫瘤中始終居首位。2014年全球女性乳腺癌新發(fā)病例和死亡病例分別占女性惡性腫瘤患者的29%和15%。雖然近年來在乳腺癌的發(fā)病機理方面已有大量的研究報道,并且有些靶點也已開發(fā)靶向藥物用于臨床治療,但是療效并不樂觀,轉(zhuǎn)移和復發(fā)仍然是對乳腺癌患者的極大威脅。因此亟需進一步深入研究和完善乳腺癌發(fā)病的分子機制,為其診治提供新策略、新思路。微小RNA (microRNA, miRNA, miR)是新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性表達的單鏈短序列小RNA,長度約19-25個核苷酸序列,不編碼蛋白質(zhì),廣泛存在于真核細胞中,在進化上具有保守性。研究發(fā)現(xiàn)microRNA與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。microRNA的發(fā)現(xiàn)為研究完善乳腺癌的發(fā)病機制提供了極大的補充,具有廣闊的應用前景。本課題檢測了miR-372在乳腺正常上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達情況；成功建立穩(wěn)定高表達miR-372的乳腺癌細胞株(MCF7-miR-372);通過裸鼠荷瘤實驗明確了miR-372在乳腺癌細胞增殖中的作用；并利用生物信息學方法篩選了miR-372下游的可能靶基因,并進一步通過實驗證實p62是miR-372的下游靶標基因之一。本課題的研究成果將加深我們對乳腺癌發(fā)病的分子機理的了解,為乳腺癌的早期診斷和治療提供新的線索,同時將可能為相關(guān)的新藥開發(fā)提供重要的分子靶點。 1.目的 研究miR-372在乳腺癌中的作用并探討其相關(guān)機制。 2.材料和方法 2.1應用實時熒光定量PCR分析乳腺正常上皮來源的永生化細胞株MCF.10A和乳腺癌細胞株MCF-7, T47D, Bcap-37中miR-372的表達情況。 2.2利用慢病毒載體pLVX-miRNA,構(gòu)建miR-372過表達質(zhì)粒(pLVX-miR-372),與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,包裝出高滴度的病毒顆粒并感染MCF-7細胞,用嘌呤霉素(puromycin)篩選獲得穩(wěn)定表達miR-372的細胞株(MCF-7-miR-372). 2.3建立裸鼠皮下移植瘤模型。將BALB/c裸鼠隨機分為兩組(實驗組和對照組,每組8只),將MCF-7-miR-372細胞和MCF-7-vector細胞的細胞懸液分別接種于兩組裸鼠右腋皮下,從接種后第7天開始記錄數(shù)據(jù),每周兩次測量瘤體大小(最大和最小直徑),動態(tài)觀察、測量并記算腫瘤體積大小及荷瘤鼠體重。在接種后第29天時用頸椎脫臼法處死裸鼠,剝離移植瘤組織,稱量瘤體重量,繪制生長曲線。 2.4利用TargetScan, miRanda二個預測軟件和GO功能富集分析方法,綜合分析相關(guān)因素,篩選出miR-372可能的下游靶點p62。利用蛋白免疫印跡(Western Blot實驗)檢測乳腺癌細胞中過表達miR-372前后p62蛋白水平的改變；利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證miR-372對p62的靶向調(diào)控作用。 3.結(jié)果 3.1與乳腺正常上皮來源的永生化細胞株MCF-10A相比,miR-372在乳腺癌細胞株MCF-7、T47D、Bcap-37中的表達均顯著下調(diào)。 3.2成功包裝了miR-372過表達慢病毒并篩選建立穩(wěn)定高表達miR-372的乳腺癌細胞株MCF-7-miR-372. 3.3體內(nèi)動物實驗表明MCF-7-miR-372組(實驗組)的裸鼠體內(nèi)腫瘤體積和腫瘤重量都顯著小于MCF-7-vector組(對照組)(p0.05),具有統(tǒng)計學差異,表明過表達miR-372能顯著抑制乳腺癌細胞的體內(nèi)增殖能力。 3.4Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)MCF-7-miR-372細胞中的p62蛋白水平顯著低于對照組細胞,提示miR-372可能負向調(diào)控p62的表達。雙熒光素報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實miR-372能通過與p623-UTR結(jié)合,從而抑制p62的翻譯。以上兩方面的結(jié)果表明,p62很可能是miR-372直接作用的下游靶基因。 4.結(jié)論 4.1miR-372在乳腺癌細胞中表達下降,提示miR-372在乳腺癌中可能起到腫瘤抑制因子的作用。 4.2過表達miR-372能顯著抑制乳腺癌細胞的成瘤能力,表明miR-372在乳腺癌中起腫瘤抑制因子的作用。 4.3miR-372可能通過靶向抑制p62在乳腺癌細胞中的表達水平,從而參與調(diào)控乳腺癌細胞的增殖。
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圖1 microRNA生成和作用通路示意圖2002年11月Croce研究小組首次報道m(xù)icroRNA異常與腫瘤相關(guān)“6,目前越來越多的證據(jù)顯示microRNA在脾瘤形成的過程中扮演著重要的角色，其異常的

上海生博基因技術(shù)有限公司提供的pLVX-miRNA載體（圖譜如下圖）統(tǒng)，把構(gòu)建好的miR-372質(zhì)粒（pLVX-miR-372 )和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)T細胞包裝病毒，同時包裝對照病毒，，測定滴度后分裝保存于-801冰箱
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Hiroyuki Yamamoto;Yasushi Adachi;Hiroaki Taniguchi;Hiroaki Kunimoto;Katsuhiko Nosho;Hiromu Suzuki;Yasuhisa Shinomura;;Interrelationship between microsatellite instability and microRNA in gastrointestinal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2012年22期

本文編號：2528630