【摘要】：研究目的已報道Twist1及micro RNAs(mi RNAs)在腫瘤的進展過程中發(fā)揮重要作用,涉及腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多方面。然而,Twist1和mi RNAs之間的關(guān)系以及mi RNAs在肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用尚未明確。本研究目的在于找出Twist1促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)過程中所涉及的主要mi RNAs,并研究其在HCC進展中發(fā)揮的作用,為開展針對Twist1及其相關(guān)分子生物學(xué)事件的腫瘤分子診斷、治療和/或預(yù)后策略奠定基礎(chǔ)。研究方法1、通過mi RNAs表達譜芯片及Chip-seq技術(shù),篩選出Twist1過表達時變化明顯的mi RNAs,并應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)和Ch IP(chromatin immunoprecipitation)-PCR方法驗證結(jié)果的可靠性。2、應(yīng)用q RT-PCR的方法檢測人體肝細胞肝癌冰凍組織中所篩選的mi RNAs的表達情況,并分析其與病人臨床病理資料之間的關(guān)系。3、應(yīng)用q RT-PCR的方法檢測人體肝細胞肝癌組織中Twist1的表達,并進一步分析其與所篩選mi RNAs的相關(guān)性。4、應(yīng)用q RT-PCR的方法篩選出低表達及高表達所篩選mi RNAs的HCC細胞系,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法分別上調(diào)及下調(diào)目標(biāo)mi RNAs,并篩選出相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。隨后,q RT-PCR驗證mi RNAs轉(zhuǎn)染效果,q RT-PCR及Western Blot分別檢測EMT相關(guān)分子及VM相關(guān)分子在m RNA和蛋白水平的變化,免疫熒光檢測EMT及VM相關(guān)分子(E-cadherin、vimentin、VE-cadherin)的表達情況。5、運用侵襲實驗、遷移實驗、MTT、粘附實驗、平板克隆形成實驗及體外三維培養(yǎng)實驗檢測mi RNAs對HCC細胞侵襲、遷移、增殖及管道形成能力的影響。6、通過TargetScan,Pic Tar和mi Randa數(shù)據(jù)庫預(yù)測所篩選miRNAs下游的靶基因并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Cmi RNAs與靶基因可直接結(jié)合。在低表達所篩選mi RNAs的HCC細胞系中,通過上調(diào)mi RNA及同時上調(diào)mi RNA與靶基因,應(yīng)用q RT-PCR、Western Blot及功能實驗(侵襲實驗、遷移實驗、MTT、平板克隆形成實驗及體外三維培養(yǎng)實驗)的方法,進而驗證mi RNA與靶基因的相互作用。7、應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測人體肝細胞肝癌組織中所預(yù)測靶基因及其相關(guān)分子的表達,并進一步分析這些分子與所篩選mi RNAs的相關(guān)性。8、應(yīng)用qRT-PCR、Western Blot選出共表達且中等量表達Twist1及靶基因的HCC細胞系,通過上調(diào)靶基因及同時上調(diào)mi RNAs與靶基因,應(yīng)用q RT-PCR、Western Blot及功能實驗(侵襲實驗、遷移實驗、MTT、平板克隆形成實驗及體外三維培養(yǎng)實驗)的方法,從另一角度進一步驗證mi RNAs的作用及其與靶基因的相互作用。9、通過將穩(wěn)定過表達所篩選mi RNAs和穩(wěn)定降表達所篩選mi RNAs的HCC細胞接種到裸鼠體內(nèi),構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,進而觀察所篩選mi RNAs對HCC細胞成瘤能力及移植瘤生長的影響。同時應(yīng)用免疫組化及Endomucin/PAS雙染技術(shù)檢測瘤組織中EMT及VM相關(guān)蛋白的表達情況及VM的形成情況,進一步驗證mi RNAs對HCC疾病進展的影響。10、在中等表達Twist1及靶基因的HCC細胞系,通過上調(diào)靶基因及同時上調(diào)mi RNAs與靶基因,應(yīng)用Western Blot的方法檢測mi RNAs靶基因的上游和下游轉(zhuǎn)錄因子的表達情況,以進一步研究所篩選的mi RNAs所涉及的信號通路。研究結(jié)果1、HCC細胞系Hep G2中Twist1的過表達引起多種mi RNAs的表達變化,其中mi RNA-26b-5p(mi R-26b-5p)的表達明顯降低(P0.005),q RT-PCR驗證此結(jié)果。此外,Ch IP-PCR結(jié)果證實Twist1蛋白可與mi R-26b-5p的編碼基因在DNA水平直接結(jié)合。2、在HCC組織中,mi R-26b-5p的表達明顯低于癌旁組織,且mi R-26b-5p的表達與HCC患者的早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)(Log Rank,P=0.01)。3、與癌旁正常肝組織相比,HCC人體組織中,Twist1呈高表達。Twist1的表達與mi R-26b-5p的表達呈負相關(guān)(P=0.004,r=-0.572)。4、在HCC細胞系(H7402,Bel7402,SMMC7721,Hep G2,PLC,HCCLM3,MHCC97L,Huh7)和正常肝癌細胞系LO2中,篩選出低表達mi R-26b-5p的肝癌細胞系Bel7402,SMMC7721,高表達mi R-26b-5p的肝癌細胞系Hep G2,PLC。上調(diào)mi R-26b-5p的肝癌細胞系Bel7402和SMMC7721(Bel7402-mi R-26b-5p,SMMC-mi R-26b-5p),在m RNA和蛋白水平,均表現(xiàn)為E-cadherin表達增高,vimentin、VE-cadherin表達降低。下調(diào)mi R-26b-5p的肝癌細胞系Hep G2和PLC(Hep G2-mi R-26b-5p-inhibitor和PLC-mi R-26b-5p-inhibitor),在m RNA和蛋白水平,均表現(xiàn)為E-cadherin表達降低,vimentin、VE-cadherin表達增高。5、肝癌細胞系Bel7402,SMMC7721過表達mi R-26b-5p后,細胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成能力減弱(P0.05)。肝癌細胞系Hep G2,PLC降表達mi R-26b-5p后,細胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成能力增強(P0.05)。6、Target Scan,Pic Tar及mi Randa數(shù)據(jù)庫預(yù)測并篩選出mi R-26b-5p下游的靶基因SMAD1并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Cmi R-26b-5p可與SMAD13’—非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)直接結(jié)合。Bel7402-mi R-26b-5p細胞系上調(diào)SMAD1表達后,在m RNA和蛋白水平,均表現(xiàn)為E-cadherin表達降低,vimentin、VE-cadherin表達增高。同時,與過表達mi R-26b-5p時相比,細胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成能力增強(P0.05)。7、與癌旁正常肝組織相比,HCC人體組織中,SMAD1呈高表達;SMAD1的表達與mi R-26b-5p的表達呈負相關(guān)(P=0.035,r=-0.442)。與癌旁正常肝組織相比,HCC人體組織中,BMP4呈高表達;BMP4的表達與mi R-26b-5p的表達呈負相關(guān)(P=0.010,r=-0.524),其與SMAD1的表達呈正相關(guān)(P=0.029,r=0.455)。8、Hep G2和97L為中等共表達Twist1及SMAD1的HCC細胞系,兩種細胞系分別上調(diào)SMAD1,mi R-26b-5p及同時上調(diào)mi R-26b-5p與SMAD1后,在m RNA和蛋白水平,均表現(xiàn)為SMAD1上調(diào)組E-cadherin表達相對最低,vimentin、VE-cadherin表達相對最高;mi R-26b-5p上調(diào)組E-cadherin表達相對最高,vimentin、VE-cadherin表達相對最低;mi R-26b-5p與SMAD1同時上調(diào)組E-cadherin,vimentin、VE-cadherin的表達介于上述兩組之間。SMAD1上調(diào)組細胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成能力明顯增強;mi R-26b-5p上調(diào)組細胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成能力明顯減低;mi R-26b-5p與SMAD1同時上調(diào)組細胞的侵襲、遷移、增殖及管道形成能力介于上述兩組之間。9、SMMC-mi R-26b-5p移植瘤成瘤率低(75%),生長慢,腫瘤體積小,腫瘤組織中EMT及VM相關(guān)蛋白(vimentin、VE-cadherin、β-catenin、MMP2、Snail)表達均減弱,Smad1、BMP4蛋白表達降低,E-cadherin表達增高,Twist1表達無明顯變化;Hep G2-mi R-26b-5p-inhibitor移植瘤成瘤率高(100%),腫瘤生長慢、體積小,腫瘤組織中EMT及VM相關(guān)蛋白(vimentin、VE-cadherin、β-catenin、MMP2、Snail)表達均增高,Smad1、BMP4蛋白表達增高,E-cadherin表達降低,Twist1表達無明顯變化。10、HepG2和97L為同時中等表達Twist1及SMAD1的HCC細胞系,兩種細胞系分別上調(diào)SMAD1,mi R-26b-5p及同時上調(diào)mi R-26b-5p與SMAD1后,在蛋白水平,Smad1、β-catenin、Snail、Slug的相對表達均表現(xiàn)為SMAD1上調(diào)組相對最高;mi R-26b-5p上調(diào)組相對最低;mi R-26b-5p與SMAD1同時上調(diào)組表達介于上述兩組之間。BMP4的表達在SMAD1上調(diào)組無明顯變化;mi R-26b-5p上調(diào)組相對最低;mi R-26b-5p與SMAD1同時上調(diào)組表達介于上述兩組之間。Eph A2、SIP1及Wnt5α的相對表達在上述各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論1、Twist1通過直接結(jié)合mi R-26b-5p啟動子區(qū)序列而下調(diào)其表達。2、在HCC組織和細胞中mi R-26b-5p與Twist1的表達水平呈負相關(guān),mi R-26b-5p的低表達與病人的不良預(yù)后相關(guān)。3、mi R-26b-5p的表達與EMT的表型相關(guān),且能抑制EMT和VM的發(fā)生。4、在體外,mi R-26b-5p抑制HCC細胞遷移、侵襲、粘附、增殖、克隆形成和管道形成能力;在體內(nèi),mi R-26b-5p抑制腫瘤形成和腫瘤血管形成。5、SMAD1是mi R-26b-5p的靶基因,SMAD1的上調(diào)能部分削弱mi R-26b-5p介導(dǎo)的對EMT和VM的抑制作用以及對腫瘤細胞生物學(xué)功能的抑制作用。6、mi R-26b-5p通過靶向下調(diào)SMAD1的表達,而抑制BMP4/Smad1信號通路,進而發(fā)揮其抑制EMT和VM的功能。
【圖文】：

miRNA芯片所篩選的47個差異miRNAs的聚類分析

15圖 1-2 MA0235.1 和 MA0324.1 的 motif 分析結(jié)果1.2.3 qRT-PCR 及 ChIP-PCR 驗證 miRNA 芯片和 ChIP-seq 分析的基于 miRNA 芯片和 ChIP-seq 分析的預(yù)測結(jié)果，我們?nèi)烧? 個 miRNAs：hsa-miR-1246，hsa-miR-1260b，，hsa-miR-128，hshsa-miR-26b-5p ， hsa-miR-27a-3p 。應(yīng)用 qRT-PCR 及 ChIP-PChsa-miR-26b-5p 和 hsa-miR-27a-3p 為例，驗證 miRNA 芯片數(shù)據(jù)據(jù)的可靠性。qRT-PCR 實驗結(jié)果顯示在 HepG2 細胞系中，TwismiR-26b-5p 和 miR-27a-3p 表達下降（見圖 1-3）。我們于 m
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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