發(fā)布時間：2019-08-15 07:00

【摘要】：目前越來越多的報道揭示了細胞自噬在細胞生理過程中的重要作用和意義,細胞自噬的異常以及功能性障礙往往與人的各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及惡性行為密切相關(guān)。然而目前為止,關(guān)于細胞自噬在人的各種惡性腫瘤中發(fā)揮作用的細胞和分子機制人們還不是十分明確,更進一步的研究十分需要而且非常有意義,在各類腫瘤中,細胞自噬在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用更是知之甚少。目前為止,科學(xué)家的研究顯示,人體細胞自噬是機體正常機能的體現(xiàn),異常的細胞自噬狀況往往與人體機能紊亂、疾病的高發(fā)有關(guān),已有證據(jù)顯示人體神經(jīng)系統(tǒng)的異常、人體細胞老化和人體老齡化速度加快、癌癥的發(fā)生都與異常的細胞自噬相聯(lián)系。在人體癌癥的發(fā)生中細胞自噬究竟扮演何種角色,人們廣泛關(guān)注和研究,然而由于其作用機制復(fù)雜,在整個癌癥的起始、發(fā)生、發(fā)展、惡性變異過程中細胞自噬發(fā)揮的功能不盡相同,因此該課題引發(fā)科學(xué)界的爭論和探討。細胞自噬促進機體細胞對于惡劣環(huán)境的適應(yīng),對于癌細胞,細胞自噬的這一基本功能同樣適用,因此從一定程度上來講,細胞自噬具有促進癌適應(yīng)、生長的作用。面對正常機體對于癌細胞的排斥以及治療過程中藥物等制造的惡劣環(huán)境,細胞自噬幫助癌細胞生存和適應(yīng)。然而對于癌細胞的起始過程,由于細胞自噬幫助機體正常細胞清理廢舊物質(zhì)加以循環(huán)利用,減少了致癌物質(zhì)的堆積,幫助機體維持酸堿平衡等,因此從這個角度來看細胞自噬對于癌細胞的起始有抑制作用。在人體大部分種類的癌癥中,細胞自噬都發(fā)揮著重要作用,這從各種癌癥中細胞自噬相關(guān)蛋白的異常和介導(dǎo)的功能可以找到答案。Beclin-1,LC3B,p62等就是研究的比較多的細胞自噬基因,Beclin-1在許多種類的人體癌癥中發(fā)揮著抑癌作用,而LC3B,p62在許多種類的人體癌癥中發(fā)揮著促癌作用。在本課題中,我們收集了視網(wǎng)膜母細胞瘤病人經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋的腫瘤組織,通過組織切片利用免疫組織化學(xué)實驗方法檢測了細胞自噬標志性蛋白LC3(微管相關(guān)蛋白輕鏈3B)和p62(SQSTM1),進一步進行各種臨床病理學(xué)特征與這兩種蛋白表達量的組合相關(guān)分析,研究細胞自噬行為在人視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用。更進一步,我們分析了在人視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中LC3B和p62彼此之間的內(nèi)在聯(lián)系,以及它們與p53蛋白之間的相關(guān)性,p53蛋白是近些年新發(fā)現(xiàn)的能夠抑制細胞自噬作用的蛋白。在細胞自噬的研究中,lc3b往往用來衡量lc3蛋白的表達,而lc3蛋白是目前被普遍接受的細胞自噬標記蛋白。同時p62也是經(jīng)常用來檢測細胞自噬過程的標記蛋白,p62蛋白在細胞自噬過程中主要在降解代謝廢物中發(fā)揮具體功能。在細胞自噬過程中,lc3與p62蛋白分別在上下游過程中發(fā)揮具體功能,它們的聯(lián)合檢測也成為評價細胞自噬活性的一個指標。針對該二者的檢測,通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗可以檢測不同細胞中它們的表達水平差異,表達水平高代表著細胞自噬活性高,反之代表細胞自噬活性低;利用免疫熒光實驗可以將這兩個蛋白表達陽性的細胞用熒光標記出來,通過在熒光顯微鏡下可以直觀檢測到該兩種蛋白陽性的細胞,也就是代表了發(fā)生細胞自噬的細胞;近來,免疫組織化學(xué)技術(shù)在組織切片中檢測這兩個蛋白的表達也成為一種重要的方法,而且該技術(shù)也不斷完善,而且可以與組織病理學(xué)和形態(tài)學(xué)相聯(lián)系。在正常人體細胞中,p53基因參與了染色質(zhì)的損傷修復(fù)、細胞分裂周期、細胞程序性死亡等過程,對于維持細胞正常的細胞周期十分重要,作為一個調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程的功能性基因,p53已經(jīng)被證明并被普遍認可是一個重要的腫瘤抑制基因。對于細胞自噬,有報道顯示p53基因也發(fā)揮了一定功能,而在細胞自噬過程中發(fā)揮作用的p53主要是細胞質(zhì)p53蛋白。同時為了探討p53調(diào)節(jié)細胞自噬的上游調(diào)控機制,本研究進一步通過生物學(xué)預(yù)測加實驗驗證的方法,篩選了調(diào)節(jié)p53乃至自噬的靶向mirna。我們的實驗結(jié)果充分證明lc3b和p62蛋白的表達水平與人視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展以及惡性侵襲具有顯著正相關(guān)性。而且我們證實了p53蛋白在細胞質(zhì)中的表達水平與惡性視網(wǎng)膜母細胞瘤的侵襲能力具有顯著負相關(guān)性。p53蛋白在細胞質(zhì)中的表達水平與lc3b和p62蛋白二者之間的表達水平具有顯著負相關(guān)特征,這是通過spearman相關(guān)性分析得到的。體外研究發(fā)現(xiàn),p53可以下調(diào)lc3b和p62表達,進而抑制人視網(wǎng)膜母細胞瘤的自噬進程;并且,生物學(xué)預(yù)測結(jié)合實驗驗證顯示p53是mir-337的靶基因,mir-337通過下調(diào)細胞p53表達促進人視網(wǎng)膜母細胞瘤的自噬進程。因此,我們可以得出結(jié)論,細胞自噬在人的視網(wǎng)膜母細胞瘤中發(fā)揮著重要作用,它能夠促進視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性行為,在此過程中l(wèi)c3b和p62的表達水平可以作為疾病發(fā)展預(yù)測和診斷的指標。此外我們證明了在人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中p53能夠抑制atg5,atg7,atg12,beclin1,lc3,p62等基因的表達,從而發(fā)揮抑制細胞自噬的功能。miR-337能夠靶向抑制調(diào)節(jié)p53基因,在人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中發(fā)揮促進細胞自噬功能。
【圖文】：

圖2.1 SYBR Green 法熒光實時定量 PCR準備熒光實時定量 PCR 反應(yīng)專用的 PCR 管（八聯(lián)管），按照每檢測一個樣本的一個基因 3 個重復(fù)孔進行標記好。配制反應(yīng)混合物，大概包括 ROX 染色劑，SYBR Green 反應(yīng)酶，待檢測基因的正反向引物，模板 RT 產(chǎn)物（cDNA），用雙蒸水稀釋按照試劑說明書配制每孔20 微升系統(tǒng)的反應(yīng)液。利用熒光實時定量 PCR 儀進行反應(yīng)，一般選擇 40 循環(huán)，利用溶解曲線判斷 PCR 反應(yīng)的特異性程度。利用統(tǒng)計軟件進行分析。所用引物如下：Name Sequence5'-3'GAPDH sense 5'- TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'antisense 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'ATG5 sense 5'-AGAATAGCCAGTACAGCA-3'

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文片的組織塊大小不能太大，一般大小不能超過 2 厘米，，厚度不能超過 4本制作第二步是固定，組織固定要選取合適的固定液，一般選擇 10%甲為組織標本的固定液，固定時間要恰到好處，一般固定 3-12 小時，時間固定不充分，時間太長固定液福爾馬林會產(chǎn)生福爾馬林色素，對后續(xù)免學(xué)染色造成干擾，而且固定時間太長還會降低組織的抗原的活性，對免學(xué)中抗原抗體的特異性反應(yīng)造成影響。（甲醛溶液：中國國藥集團試劑
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.7

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