【摘要】：背景與目的根據WHO(2008)分類中的定義,將同時具有Myc和Bcl-2或Bcl-6基因易位的B細胞淋巴瘤稱為雙打擊淋巴瘤(Double Hit lymphoma,DHL),并且將同時具有三者基因易位的稱為三重打擊淋巴瘤(Triple-hit lymphoma,THL)。另一種B細胞淋巴瘤通過免疫組織化學方法檢測出同時具有MYC和BCL-2或BCL-6蛋白高表達,這類淋巴瘤稱為雙表達淋巴瘤(Double-expression lymphoma,DEL)。近年來,很多研究找尋MYC和BCL-2/BCL-6陽性表達的免疫組織化學最佳判斷閾值,通過免疫組織化學蛋白表達篩選基因易位,以確定在日常實踐中有風險的患者需通過FISH檢測。本研究通過FISH及IHC方法檢測實驗組中DLBCL(Diffuse large B cell lymphoma)的Myc、Bcl-2、Bcl-6易位情況及相應蛋白的表達情況,得出雙打擊淋巴瘤與雙表達淋巴瘤的臨床及病理特征,探討兩者的聯系并探討其預后特征及診治方案。方法1.收集資料:收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院2010年至2015年確診為DLBCL患者的石蠟包埋組織標本,經本科室兩位資深淋巴瘤醫(yī)師重新閱片診斷,并篩選出應用CHOP方案或者R-CHOP方案的患者65例,組織微陣列技術(tissuemicroarray TMA)將65例標本制成組織芯片。2.整理資料:對篩選出來的65例DLBLC患者的臨床資料和病理資料進行回顧性分析,并且對患者進行電話隨訪。3.免疫熒光原位雜交:使用Vysis LSI MYC雙色,斷裂重排探針,Vysis LSI BCL6雙色,斷裂重排探針和Vysis LSI IGH/BCL2雙重融合易位探針(Abbott Molecular,Abbott Park,IL)。使用配備有DP72照相機和DP2-BSW軟件(Olympus,Tokyo,Japan)的熒光顯微鏡(Olympus BX51,Tokyo,Japan)分析FISH信號。4.免疫組織化學:檢測MYC、BCL-2、BCL-6、CD10、MUM-1、Ki-67蛋白的表達情況。5.統(tǒng)計分析:使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析。Pearson卡方檢驗,連續(xù)性校正和Spearman秩相關分析用于確定變量之間的關聯和相關性。使用Kaplan-Meier曲線繪制生存分析并使用對數秩檢驗進行比較。通過Cox比例風險回歸模型分析單變量和多變量生存分析。當雙側P0.05時,結果被認為具有統(tǒng)計學意義。結果1.臨床資料及隨訪:65例患者,其中男34例,女31例,男女性別之比為1.1:1,年齡4-81歲,平均年齡50.8歲,中位年齡為60歲。此組患者的Ann Arbor分期為:I期21例,Ⅱ期29例,Ⅲ期10例,Ⅳ期5例。根據上述相關指標計算患者的IPI評分,其中低危者32例,低/中危者18例,中/高危者10例,高危者5例。36例患者應用CHOP方案(環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松),29例患者使用利妥昔單抗的R-CHOP方案,隨訪2至80個月,生存34例,死亡31例。2.FISH結果:在所檢測的65例DLBLC中Myc基因易位病例(14/65)占DLBCL的21.5%;Bcl-2基因易位病例占18.5%(12/65);Bcl-6基因易位占27.7%(18/65);BCL-2/IGH基因易位病例占18.5%(12/65)。7例(10.8%)腫瘤樣品中Myc基因重排是唯一的易位。檢測出6例DHL。其中4例(6.1%)具有Myc和Bcl-2基因易位,2例(3.1%)Myc和Bcl-6基因易位。9例(13.8%)Bcl-2和Bcl-6的同時易位。1例(1.5%)中檢測到Myc、Bcl-2,Bcl-6基因的三重易位。3.免疫組化結果:65例DLBCL中GCB病例16例,NON-GCB病例46例;在Myc基因易位病例中GCB占27.6%(3/16),NON-GCB占68.8%(11/16);在Bcl-2/Ig H基因易位病例中GCB占26.3%(6/12),NON-GCB占41.7%(5/12),在Bcl-6基因易位病例中GCB占33.3%(4/120,NON-GCB占58.3%(7/12)。6例DHL患者中GCB占16.7%(1/6),NON-GCB占83.3%(5/6)。一例THL為NON-GCB。在所檢測的65例DLBCL中MYC蛋白,BCL-2蛋白,BCL-6蛋白的表達情況。顯示33例(50.1%)MYC蛋白高表達,32例(49.2%)顯示BCL-2蛋白高表達,18例(27.7%)顯示BCL-6蛋白高表達。我們使用ROC曲線分析來確定百分比的最佳截止值的蛋白陽性細胞。MYC,BCL-2和BCL-6的最佳臨界值為≥50%,≥60%(等于預定閾值)和≥20%。Myc易位陽性病例(14例)中13例患者具有MYC蛋白高表達,特異性為90%。Bcl-2易位陽性病例(12例)有7例患者具有BCL-2蛋白高表達,特異性為58%。Bcl-2易位陽性病例(18例)有11例患者具有BCL-62蛋白高表達,特異性為61%。4.預后分析:6位DHL患者中的3例使用R-CHOP方案治療,3例使用CHOP方案治療,兩組之間生存率并沒有特異性。6例DHL患者全部死亡,生存期2-19個月,預后極差。1例THL生存8個月。與MYC易位相反,BCL-2或BCL-6基因的斷裂并不能預測患者的OS和PFS。在CHOP和R-CHOP隊列中分別評估了候選的預后因素。生存曲線顯示MYC蛋白高表達在CHOP和R-CHOP組中與劣質OS顯著相關。在CHOP隊列中,BCL-2高蛋白表達與不良OS顯著單獨相關,但是不在R-CHOP隊列中。然而,BCL-6蛋白高表達在R-CHOP隊列中是不良預后因素,但是不在CHOP隊列中。接下來我們分析DHS和THS對兩個治療組中的DLBCL患者的預后影響。在單變量分析中,在CHOP和R-CHOP組中,MYC/BCL-2蛋白高表達,MYC/BCL-6蛋白高表達和MYC,BCL-2和BCL-6三高蛋白表達都與不良OS相關。在R-CHOP隊列中,當共表達MYC蛋白時,BCL-2高蛋白表達僅與較差的OS相關。BCL-2/BCL-6高表達顯示有限的預后影響。在CHOP隊列中,并入IPI,免疫組織化學分組(GCB對NON-GCB),MYC,BCL-2和BCL-6蛋白的多變量Cox回歸模型顯示IPI,高MYC蛋白表達和高BCL2蛋白表達,MYC/BCL-2高蛋白表達,MYC/BCL-6高蛋白表達,BCL-2/BCL-6高蛋白表達和三高蛋白表達獨立影響OS的預后值。在R-CHOP隊列中,并入IPI,MYC,BCL-2和BCL-6蛋白的多變量Cox回歸模型顯示:高MYC蛋白表達,高MYC/BCL-2 DHS,高MYC/BCL6 DHS和高THS對于不良OS和PFS具有獨立的預后價值。高BCL2/BCL6 DHS同樣也是獨立的預后值。兩組治療方案患者的Cox模型顯示,MYC高蛋白表達顯示與Myc基因斷裂沒有相關性,BCL-6高蛋白表達顯示與Bcl-6斷裂沒有相關性,BCL-2高蛋白表達顯示與IGH/Bcl-2融合沒有相關性。并入變量Myc斷裂與DHS的Cox模型顯示,IHC組或FISH組模型中的隊列可以代表整個DHL患者人群并沒有統(tǒng)計學意義。結論1.DHL與DEL患者具有高LDH水平,臨床分期多為Ⅲ-Ⅳ期,多個結外部位的侵及,和高IPI評分的臨床病理特征。2.對于MYC,BCL-2和BCL-6蛋白表達,具有50%,60%和20%的最佳Cut-Off值預測了通過FISH在DLBCL中檢測到的Myc斷裂,最終我們檢測到的Myc斷裂存在高特異性(90%),但是IGH/Bcl-2融合和Bcl-6斷裂的并未發(fā)現高特異性。3.DHL患者的CHOP與R-CHOP方案并不能有效改善患者預后。
【圖文】：

圖 14.3 熒光原位雜交信號判讀(參照產品說明書)陽性結果判讀：Myc基因與Bcl-6基因分離：易位陽性的每個細胞出現兩個分離的紅色和綠色信號或者一個分離信號，一個正常紅/綠融合信號，也可出現為以紅色或綠色占優(yōu)勢的非配對的易位信號。IGH/Bcl-2基因融合：正常顯示分開的2對紅綠信號，易位陽性出現1-2個紅/綠融合信號伴隨或不伴隨一對分開的紅綠信號。分離及融合陽性都是在油鏡下計數200個細胞核，以超過20%的腫瘤細胞核出現分離或融合信號視為基因易位陽性。5 隨訪以電話形式進行隨訪，起始時間為病理確診時間，隨訪止于2016年1月1日，隨訪時間為2-80個月。記錄患者至隨訪終點的生存狀態(tài)，若患者死亡，則記錄其死亡時間，計算所有患者的生存時間。

臨床資料及隨訪：本研究中65例患者，男34例，女31例，比例為1.1:1，齡4～81歲，平均年齡50.8歲，中位年齡為60歲。根據AnnArbor分期標準：I期者21例，Ⅱ期患者29例，Ⅲ期患者10例，Ⅳ患者期5例。患者IPI評分結果顯示低危者32例，低／中危者18例，中／高危者10例，高危者5例。36例患者應用CHO方案，，29例患者加用利妥昔單抗的R-CHOP方案，65例患者，隨訪至2016年1月日，隨訪2至80個月，生存34例，死亡31例。2 Fish 結果14 例（21.5％）發(fā)現了 Myc 基因的重排，18 例（28.7％）發(fā)現了 Bcl-6 因的重排，12 例（18.5％）發(fā)現了 Bcl-2 基因的重排（圖 2）。7 例（10.8％）瘤樣品中的 MYC 基因重排是唯一的易位。65 例 DLBCL 中 4 例（6.1％）具Myc 和 Bcl-2 基因易位，2 例（3.1％）Myc 和 Bcl-6 基因易位，9 例（13.8％Bcl-2 和 Bcl-6 基因的同時易位。故確診 DHL 患者為 6 例。1 例（1.5％）中檢到 Myc、Bcl-2，Bcl-6 基因的三重易位，為 THL。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.1

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