【摘要】：研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血液病中最常見的疾病。目前,藥物化療是治療AML的主要方法,大部分患者可以經(jīng)過化療后得到緩解。但是,部分患者在經(jīng)過治療后不能得到完全緩解,另外,完全緩解后的患者中仍有很大部分會復發(fā),最終導致治療失敗。白血病細胞的原發(fā)耐藥及復發(fā)耐藥是治療失敗的主要原因。深入探索白血病細胞耐藥過程中的分子機制,提高白血病細胞對治療藥物的敏感性是目前研究的熱點。SIRT2是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依賴性的第三類組蛋白去乙�；窼ir2家族成員之一,可通過去乙�；饔脜⑴c細胞分化、細胞內(nèi)信號轉導、細胞遷移、增殖等活動。研究表明SIRT2可參與調節(jié)AML細胞的增殖、凋亡和分化活動,但其在AML細胞多藥耐藥中的作用和機制尚不明確。目的：在原發(fā)和復發(fā)AML患者細胞中篩查SIRT2是否參與AML對藥物的耐受性,并以AML耐藥細胞株HL60/A及對藥物相對敏感的親代細胞株HL60為研究對象,研究SIRT2在多藥耐藥中的生物學作用及其機制。方法：1、對2013年4月～2014年1月中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院收治的25例兒童急性淋巴細胞白血病(children acute lymphoblastic leukemia, children-ALL)患者,20例成人急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者,10例原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)患者,11例慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)患者,8例真性紅細胞增多癥(polycythemia vera, PV)患者,11例骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm, MPN)患者及15例AML患者骨髓標本進行研究,并收集6例正常供者骨髓標本為對照。分離單個核細胞,應用實時定量PCR方法檢測骨髓單個核細胞中SIRT2基因的表達水平；2、對2013年4月～2014年1月本院收治的15例原發(fā)AML患者及10例復發(fā)AML患者骨髓標本進行研究,分離單個核細胞,應用實時定量PCR方法檢測骨髓單個核細胞中SIRT2基因的表達水平；3、應用實時定量PCR方法及Western Blot的方法檢測AML耐藥細胞株HL60/A及對藥物相對敏感的親代細胞株HL60中的SIRT2的表達水平；4、利用RNA干擾方法,構建靶向SIRT2基因的特異性干擾載體,轉染SIRT2高表達的HL60/A細胞株,并采用RT-PCR、免疫熒光和Western Blot方法檢測下調后細胞內(nèi)SIRT2的表達變化,篩選獲得SIRT2表達水平下調的細胞(HL60-SIRT2-sh)。采用激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素(doxorubicin, DOX)在細胞內(nèi)的蓄積,MTT實驗檢測SIRT2沉默前后HL60/A細胞分別對藥物柔紅霉素 (daunorubicin, DNR)和阿糖胞苷(arabinocytidine, Ara-C)敏感性的變化,利用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI雙染及Western Blot方法檢測SIRT2沉默對柔紅霉素和阿糖胞苷誘導細胞凋亡能力的影響：5、利用分子克隆技術構建SIRT2的慢病毒表達載體,轉染SIRT2低表達的HL60細胞,使其過表達SIRT2,采用RT-PCR、免疫熒光和Vestern Blot方法檢測上調后細胞內(nèi)SIRT2的表達變化,篩選獲得SIRT2表達上調的細胞(HL60-SIRT2)。采用激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素(DOX)在細胞內(nèi)的蓄積,MTT實驗檢測過表達SIRT2前后HL60細胞對藥物柔紅霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的變化,利用Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI雙染及Western Blot方法檢測過表達SIRT2對柔紅霉素和阿糖胞苷誘導細胞凋亡能力的影響；6、采用Western Blot方法檢測上述干擾、過表達SIRT2基因的細胞中多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP1)的變化,對ERK1/2、磷酸化ERK1/2表達的影響以及相關蛋白P53和BCL-2的表達變化,進一步采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究ERK1/2信號通路在SIRT2參與調控AML多藥耐藥過程中的作用。結果：1、在多種白血病患者細胞中SIRT2的表達水平均明顯高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；復發(fā)AML患者與原發(fā)AML患者比較,細胞中SIRT2的表達量增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；2、在AML耐藥細胞株HL60/A中,SIRT2 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于其親代細胞系HL60(P0.05)；3、成功構建了SIRT2穩(wěn)定干擾的HL60/A細胞株：HL60-SIRT2-shl及HL60-SIRT2-sh2;激光共聚焦顯微鏡檢測反射紅色熒光的阿霉素(DOX)在細胞內(nèi)的蓄積,結果顯示SIRT2表達下調使得阿霉素在細胞內(nèi)的蓄積量增加；MTT實驗結果顯示沉默SIRT2基因后增加了HL60/A細胞對柔紅霉素和阿糖胞苷藥物的敏感性；凋亡實驗結果顯示SIRT2基因沉默的HL60/A細胞在柔紅霉素、阿糖胞苷藥物分別處理后凋亡細胞所占比例均比對照組升高,凋亡效應蛋白caspase-3、caspase-7、 caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均較對照組明顯增加,表明SIRT2基因沉默使多藥耐藥細胞株HL60/A對阿霉素、柔紅霉素及阿糖胞苷的敏感性增強；4、成功構建了SIRT2過表達的HL60細胞株(HL60-SIRT2);激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素在細胞內(nèi)的蓄積,結果顯示SIRT2的過表達使得阿霉素在細胞內(nèi)的蓄積量減少；MTT實驗結果顯示過表達SIRT2后,HL60細胞對柔紅霉素和阿糖胞苷藥物的敏感性減弱；凋亡實驗結果顯示過表達SIRT2的HL60細胞在柔紅霉素、阿糖胞苷藥物分別處理后凋亡細胞所占比例均較對照組降低,凋亡效應蛋白caspase-3、 caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均較對照組明顯減少,表明SIRT2的過表達使HL60細胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的敏感性降低；5、檢測SIRT2基因沉默與過表達細胞中MRP1的表達,結果顯示在SIRT2基因沉默的HL60/A細胞中MRP1的表達量降低,而在SIRT2基因過表達的HL60細胞中MRP1的表達量增高,表明SIRT2能夠調節(jié)MRP1的表達水平；在SIRT2基因沉默的細胞中ERK1/2及其磷酸化水平、P53和BCL-2的表達水平均有變化,其中ERK1/2及其磷酸化水平和BCL-2表達量均降低,P53表達量增高；而在SIRT2基因過表達的細胞中這些蛋白的表達量或磷酸化水平的變化與SIRT2基因沉默細胞中的變化相反；提示在AML細胞中SIRT2表達量的變化能引起ERK1/2相關信號通路活性的改變；6、進一步采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究ERK1/2信號通路在SIRT2參與調控AML多藥耐藥過程中的作用。結果顯示,在SIRT2基因沉默的HL60/A細胞或SIRT2基因過表達的HL60細胞中,加入ERK1/2信號通路抑制劑PD98059之后,均能夠參與由SIRT2表達量變化所應起的相應改變,提示SIRT2通過調節(jié)ERK1/2信號通路的活性影響AML多藥耐藥。結論：1、在兒童ALL、成人ALL、ET、CML、PV、MPN及AML等血液病患者骨髓中存在SIRT2高表達的現(xiàn)象,AML中復發(fā)患者骨髓細胞中SIRT2的表達量高于原發(fā)患者。在AML耐藥細胞株HL60/A中,SIRT2基因的表達量明顯高于對藥物敏感的親代細胞HL60。上述研究結果首次報道SIRT2在多種血液病中的表達情況,提不SIRT2可能參與急性髓系白血病多藥耐藥的過程。2、SIRT2的表達能夠正調控AML細胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的耐藥水平,在SIRT2高表達的HL60/A細胞中下調SIRT2的表達能夠減弱HL60/A細胞對柔紅霉素等藥物的耐藥能力,而在SIRT2相對低表達的HL60細胞中過表達SIRT2則能夠增加HL60細胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的耐藥能力,以上研究結果證實了SIRT2的表達水平能夠調節(jié)AML細胞對阿霉素、柔紅霉素等藥物的耐藥能力。此外,研究還揭示ERK1/2信號通路介導了SIRT2在AML細胞多藥耐藥過程中的調節(jié)作用。研究為探索SIRT2在一些血液病發(fā)生發(fā)展過程中的作用和進一步闡明AML細胞的多藥耐藥機制奠定了理論基礎。
【圖文】：

代表與正常對照組相比，，尸＜0．0５，代表與正常對照照組相比，尸＜０．００１。逡逑ｅ邋ｍ民ＮＡ邋ｅｘｐ化ｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｉｎ邋ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｍｏｎｏｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｕｋｅｍｉａ邋ｗａｓ邋ｄｅｔ；ｅｃｌ；ｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ｑｕａｎｔｉｌ；ａｔｉｖｅ邋Ｐｅａｎ±ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ邋ｉｎ邋ａｎ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．邋＊尸＜ｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑ＮＡ在原發(fā)性和復發(fā)性ＡＭＬ患者骨髓單個核細胞中液病中的xO究僅有關于ＳＩＲＴ２參與調節(jié)急性髓系白早幼粒細胞白血病細胞分化的報道。在己有的報道量隨著病人病情的加重而增多，然而針對這一現(xiàn)象并提示我們ＳＩＲＩ７可能參與調節(jié)ＡＭＬ細胞的多藥耐原發(fā)性ＡＭＬ患者的骨髓標本和１０例復發(fā)性ＡＭＬ患單個核細胞，采用實時定量ＰＣＲ方法統(tǒng)計ＳＩＲＴ２邋ｍＳＩＲＴ２在復發(fā)性ＡＭＬ患者骨髓單個核中的表達量確異具有顯著性意義ＣＰ＜０．００１）。逡逑逡逑

中國醫(yī)學科學院北扣協(xié)和醫(yī)學院辟±研巧化學位論文ｅｌａｔｉｖｅ邋ｍ民ＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｉ打邋ｂｏｎｅ邋ｍａｒｒｏｗ邋ｍｏ打０打ｕｃｎｏｓｅｄ邋ＡＭＬ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ａ打ｄ邋ｒｄａｐｓｅ邋ＡＭＬ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｋｄ邋ＰＣ民．Ｅａｃｈ邋ｖａｌｕｅ邋ｉｎｄｉｃａｋｄ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎｉＳＤ邋ｏｆ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ邋ｉｎ邋ａｎr>尸＜０．００１，ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗ地邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑在ＡＭＬ細胞系中的表達逡逑胞和ＨＬ６０／Ａ細胞中Ｓ化Ｔ２ｍ民ＮＡ水平的表達逡逑示ＳＩＲＴ２可能參與ＡＭＬ的多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，為了進一藥耐藥現(xiàn)象中的作用及其可能的作用機制，我們選取了對藥胞系ＨＬ６０和相應的具有一定耐藥性的ＨＬ６０／Ａ細胞株進行量ＰＣＲ方法檢測ＳＩＲＴ２邋ｍＲＮＡ在ＨＬ６０細胞和ＨＬ６０／Ａ細胞明ＳＩＲＴ２在耐藥細胞株化６０／Ａ中的表達量高于化６０細胞（b6＜0．0１）。逡逑＜逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

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本文編號：2521407