【摘要】：癌癥獨特的能量代謝方式是其惡性表型的標(biāo)志性特征之一,發(fā)展針對癌癥能量代謝的治療手段將是實現(xiàn)癌癥有效治療的新方向。有多篇報道指出細(xì)胞小窩結(jié)構(gòu)的成分蛋白:小窩蛋白1 (caveolin-1,Cav-1)與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān),同時小窩結(jié)構(gòu)也是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行信息交換的橋梁,其運(yùn)動性是其功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。本文通過研究Cav-1/小窩結(jié)構(gòu)內(nèi)吞及運(yùn)動性信號途徑,以及Cav-1和線粒體之間的相互作用,揭示Cav-1在細(xì)胞能量代謝中所扮演的角色,以及Cav-1運(yùn)動性的關(guān)鍵作用,取得的主要研究成果如下:1. RalA調(diào)節(jié)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞過程:(a)通過考察牛血清白蛋白(BSA,bovine serum albumin)誘導(dǎo)的內(nèi)吞過程中RalA活化狀態(tài)的變化,證明內(nèi)吞過程可觸發(fā)RalA活化。(b)通過檢測RalA持續(xù)活化突變體和顯性負(fù)突變體對內(nèi)吞以及RalA,Cav-1結(jié)合水平的影響,說明內(nèi)吞過程的實現(xiàn)以及RalA與Cav-1的結(jié)合都需要RalA活化。(c)利用siRNA的方法抑制RalA的表達(dá),同時轉(zhuǎn)染質(zhì)�；謴�(fù)其表達(dá),對比抑制前后以及恢復(fù)表達(dá)后內(nèi)吞水平的變化,證明RalA是Cav-1 /小窩內(nèi)吞的重要調(diào)節(jié)分子。2. RalA通過活化下 游效應(yīng)分子PLD (Phospholipase D)調(diào)節(jié)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞:(a)通過研究PLD二非特異性抑制劑對內(nèi)吞的影響,證實PLD活化對內(nèi)吞的促進(jìn)作用。(b)采用PLD1和PLD2特異性抑制劑確定只有PLD2是內(nèi)吞的調(diào)節(jié)分子。(c) PLD2抑制劑和突變體對Cav-1-RFP運(yùn)動性的抑制再次證實PLD2在此過程中的重要作用。(d)通過PA感應(yīng)器GFP-PASS (phosphatidic acid biosensor with superior sensitivity)觀察內(nèi)吞過程中 PLD2 下游產(chǎn)物 PA(phosphatidic acid)在小窩生成并由此促進(jìn)Cav-1/小窩依賴的內(nèi)吞。3. Cav-1抑制引起線粒體形態(tài)學(xué)的改變:(a)采用siRNA的手段抑制Cav-1的表達(dá),同時觀察線粒體形態(tài),發(fā)現(xiàn)線粒體呈現(xiàn)片段化和增長的雙重改變。(b)利用PA-GFP (photoactive-GFP)在線粒體的擴(kuò)散程度量化線粒體的基質(zhì)融合程度,此結(jié)果亦可代表線粒體的動態(tài)水平。對比Cav-1抑制前后,發(fā)現(xiàn)抑制后細(xì)胞的線粒體有更高的動態(tài)水平。(c)通過 FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)方法測試基質(zhì)蛋白的運(yùn)動速率,進(jìn)一步強(qiáng)化Cav-1抑制提升線粒體動態(tài)水平的結(jié)論。4. Cav-1通過抑制Mfn2和Drpl的線粒體定位改變線粒體動態(tài):(a)線粒體組分分離發(fā)現(xiàn)抑制Cav-1,Mfn2和Drpl在線粒體的表達(dá)量增加。(b)通過免疫共沉淀和 FRET (fluorescence resonance energy transfer)的方法證實 Cav-1 分別與Mfn2和Drp1二者結(jié)合。(c)免疫熒光染色同樣檢測到抑制Cav-1時Drp1在線粒體的定位增加。(d)引入ER和線粒體的人工鏈接分子OMM-ER-mRFP加強(qiáng)ER和線粒體交互,發(fā)現(xiàn)Mfn2在Cav-1抑制的情況下發(fā)生ER回流,說明Cav-1可能通過調(diào)節(jié)ER和線粒體交互來調(diào)整Mfn2在二者的表達(dá)水平。5. Cav-1的抑制是線粒體自噬的誘因:(a)對比Cav-1抑制前后線粒體比量的變化發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制導(dǎo)致線粒體比量減少。(b)通過對比細(xì)胞自噬標(biāo)志分子表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制細(xì)胞的自噬水平升高。(c)引入mt-Keima檢測線粒體自噬,證實Cav-1的低表達(dá)可誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生。6. RalA通過Cav-1影響線粒體功能和細(xì)胞能量代謝:(a)采用siRNA的手段實現(xiàn)RalA和Cav-1的單獨和共同抑制。(b)檢測MMP,ATP,H2O2和糖酵解產(chǎn)物L(fēng)-lactate的生成,發(fā)現(xiàn)RalA和Cav-1抑制的細(xì)胞中出現(xiàn)MMP和ATP生成的降低以及H2O2和L-lactate的增加,并且RalA和Cav-1共同抑制時與單獨抑制Cav-1結(jié)果無異,證明RalA的作用是借Cav-1發(fā)揮的�？傊�,本論文通過對Cav-1/小窩內(nèi)吞途徑的分析確立了 RalA在此過程中的重要調(diào)節(jié)作用,并證實該作用是通過其下游效應(yīng)分子PLD催化PA在小窩生成而實現(xiàn)的。通過研究Cav-1與線粒體的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Cav-1抑制Mfn2和Drp1的線粒體表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體動態(tài)水平和線粒體自噬。最后將RalA和Cav-1聯(lián)系起來,說明Cav-1的表達(dá)水平和運(yùn)動性均能對線粒體功能和細(xì)胞能量代謝帶來重大影響。
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【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R73-3

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本文編號：2516206