【摘要】：近年來(lái)肺癌的發(fā)病率與死亡率迅速上升,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。小細(xì)胞肺癌約占肺癌的20%,其惡性程度高、生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)移快、對(duì)化療和放療敏感,初治緩解率高,但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥和放療抵抗、預(yù)后差。隨著立體定向放射外科、放射治療設(shè)備和技術(shù)的飛速發(fā)展,放射治療為肺癌患者提供了非常有效的治療手段。然而,腫瘤細(xì)胞在放射治療中后期往往產(chǎn)生不同程度的輻射耐受性,從而降低了放射治療預(yù)期的療效。mi RNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在腫瘤的形成、增殖、凋亡、化療耐藥以及放療抵抗中起著重要的作用,因此,miRNA的研究對(duì)腫瘤的診斷及治療具有重大意義。miRNA-22是一種腫瘤抑制因子,miRNA-22高表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究的目的在于探究mi R-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446放療敏感性的影響,并進(jìn)一步挖掘相關(guān)的分子機(jī)制,為改善小細(xì)胞肺癌的放射治療效果提供新思路。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.RT-qPCR檢測(cè)miR-22在人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明,miR-22在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446的表達(dá)顯著降低。2.利用miR-22模擬物(mimics)及其對(duì)照(nc),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446,建立miR-22過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。利用mi R-22抑制物(inhibitors)及其對(duì)照(inhibitors nc),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446,建立mi R-22敲低的細(xì)胞系。選擇載體pLKO.1構(gòu)建miR-22過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446,建立miR-22過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。利用RT-qPCR技術(shù)分別檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞株,結(jié)果與預(yù)期相符,表明miR-22過(guò)表達(dá)和敲低的細(xì)胞系以及miR-22過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。3.采用0Gy、2Gy、4Gy的γ射線(xiàn)照射miR-22不同表達(dá)水平的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446,通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)和Ki-67抗體檢測(cè)miR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,在γ射線(xiàn)不同劑量照射條件下,miR-22過(guò)表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖,而miR-22敲低顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,并且隨著照射劑量的增加趨勢(shì)更加明顯。采用APC Annexin V/PI雙染法,并借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,miR-22過(guò)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色,并借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)miR-22對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446的周期幾乎無(wú)影響。利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移,發(fā)現(xiàn)miR-22過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446的遷移能力。4.通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Target Scan和Pictar預(yù)測(cè)miR-22的靶基因,尋找共同的預(yù)測(cè)靶基因,通過(guò)NCBI搜索和文獻(xiàn)檢索,選擇與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因WRNIP1進(jìn)行驗(yàn)證。采用RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),驗(yàn)證WRNIP1與mi R-22的靶向關(guān)系。結(jié)果表明,WRNIP1是miR-22的直接靶基因,miR-22對(duì)WRNIP1具有負(fù)向調(diào)控作用。5.選擇miR-22過(guò)表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株及其空載對(duì)照進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,尋找與細(xì)胞增殖、遷移和凋亡相關(guān)的差異表達(dá)基因(KLK8、PC、SCUBE1、STC1和GPM6A),進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在miR-22過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株中,KLK8表達(dá)下調(diào),其它四個(gè)基因均表達(dá)上調(diào),符合理論預(yù)期。因此,推測(cè)miR-22抑制NCI-H446細(xì)胞增殖和遷移可能與KLK8、PC和SCUBE1基因相關(guān),miR-22促進(jìn)NCI-H446細(xì)胞凋亡可能與STC1和GPM6A基因相關(guān)。初步闡釋了miR-22增加小細(xì)胞肺癌放療敏感性的分子機(jī)制。
[Abstract]:In recent years, the incidence and mortality of lung cancer have risen rapidly, which is a serious threat to the health of human life. The small-cell lung cancer accounts for 20% of the lung cancer, the malignant degree of the small-cell lung cancer is high, the growth is rapid, the transfer is fast, the chemotherapy and the radiotherapy are sensitive, the initial treatment response rate is high, the secondary drug resistance and the radiotherapy resistance are easy to occur, and the prognosis is poor. With the rapid development of stereotactic radiosurgery, radiotherapy equipment and technology, radiation therapy provides a very effective means of treatment for patients with lung cancer. However, the tumor cells tend to produce different degrees of radiation resistance in the middle and later stages of radiation therapy, thus reducing the expected therapeutic effect of radiation therapy. Mi-RNA is an endogenous non-coding small-molecule RNA, plays an important role in the formation, proliferation, apoptosis, chemotherapy resistance and radiotherapy resistance of the tumor, and therefore, the research of miRNA is of great significance to the diagnosis and treatment of the tumor. MiRNA-22 is a tumor suppressor, and the high expression of miRNA-22 can significantly inhibit the proliferation and invasion of tumor cells. The purpose of this study was to explore the effect of mi R-22 on the sensitivity of NCI-H446 radiotherapy for small cell lung cancer cell lines, and to further explore relevant molecular mechanisms to provide a new way to improve the therapeutic effect of small cell lung cancer. The main contents of this study are as follows:1. RT-qPCR is used to detect the mRNA expression level of miR-22 in human normal lung epithelial cell line (BEAS-2B) and small-cell lung cancer cell line (NCI-H446). The results showed that the expression of miR-22 in small cell lung cancer cell line NCI-H446 was significantly decreased. The miR-22 mimetics and its control (nc) were used to transiently transfect the small cell lung cancer cell line NCI-H446 to establish a miR-22 overexpression cell line. Small cell lung cancer cell line NCI-H446 was transiently transfected with the mi R-22 inhibitor and its controls, and a cell line with a low mi R-22 was established. The expression plasmid of miR-22 was constructed by selection of vector pLKO.1, and the recombinant plasmid and its no-load plasmid were transfected into small-cell lung cancer cell line NCI-H446, respectively, and the expression of miR-22 was established. The positive cell line was detected by RT-qPCR. The results showed that the expression of miR-22 and the knockdown of the cell line and the expression of miR-22 were successful. The effects of miR-22 on the proliferation of small-cell lung cancer cells were detected by MTS assay, colony formation assay and Ki-67 antibody. The results showed that the expression of miR-22 significantly inhibited the proliferation of the cells under different doses of X-ray, and the knockdown of miR-22 significantly promoted the cell proliferation, and the trend of the increase of the irradiation dose was more obvious. The effect of miR-22 on the apoptosis of small cell lung cancer cells was detected by using the APC Annexin V/ PI double staining method. The results show that the overexpression of miR-22 can promote the apoptosis of cells. It was found that miR-22 had little effect on the cycle of NCI-H446 in small-cell lung cancer cells by using propidium iodide (PI) and cell cycle experiment by flow cytometry. Using the scratch test to detect cell migration, it was found that the overexpression of miR-22 could significantly inhibit the migration of small-cell lung cancer cells NCI-H446. The target gene of miR-22 was predicted by Bioinformatics database Target Scan and Pictar, and a common predicted target gene was found, and a gene WRNIP1 associated with DNA damage repair was selected by NCBI search and literature search. The targeting relationship between WRNIP1 and mi R-22 was verified by RT-qPCR, Western blot and double-luciferase reporter gene. The results show that WRNIP1 is a direct target gene of miR-22, and miR-22 has a negative control effect on WRNIP1. A high-throughput transcriptome sequencing was performed on a stable and no-load control of miR-22 overexpression to find differential expression genes associated with cell proliferation, migration and apoptosis (KLK8, PC, SCUBE1, STC1, and GM6A) for RT-qPCR validation. The results showed that the expression of KLK8 was down-regulated in the expression of miR-22 and the expression of KLK8 was up-regulated and the expression of KLK8 was up-regulated. Therefore, it is presumed that miR-22 inhibits the proliferation and migration of NCI-H446 cells and may be related to KLK8, PC and SCUBE1 genes, and miR-22 promotes the apoptosis of NCI-H446 cells, which may be related to the STC1 and GM6A genes. The molecular mechanism of the sensitivity of miR-22 to the radiotherapy sensitivity of small cell lung cancer is explained.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：2507298