【摘要】：背景:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma)、也稱(chēng)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Glioblastoma multiforme,GBM),是一類(lèi)分子異質(zhì)性極強(qiáng)、且臨床結(jié)局較差的腫瘤性疾病。在所有腫瘤相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制中,DNA甲基化在決定腫瘤生物學(xué)特征方面發(fā)揮非常重要的作用,其中包括(但不局限于)調(diào)控基因表達(dá)水平和維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。既往研究表明,GBM通常伴隨著顯著的表觀遺傳學(xué)改變,其中以全局性非基因區(qū)域DNA重復(fù)序列的低甲基化改變和局部基因區(qū)域鑲嵌有CpG島(Cp G island,CGI)超甲基化改變的低甲基化區(qū)段最具特征性。遺憾的是,目前我們對(duì)于GBM相關(guān)的DNA低甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用和意義還了解甚少。研究表明:腫瘤基因組DNA甲基化整體水平的下降主要來(lái)自于非基因區(qū)域DNA重復(fù)序列的甲基化丟失。另一方面,腫瘤相關(guān)的DNA超甲基化改變則主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子相關(guān)區(qū)域的CpG島結(jié)構(gòu)內(nèi)。然而,人類(lèi)基因組中有將近一半的基因,其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域并不含有CpG島結(jié)構(gòu),該區(qū)域內(nèi)DNA甲基化在腫瘤中的改變模式目前尚未有明確結(jié)論。本研究旨在利用高通量DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)從組學(xué)的水平上探討GBM轉(zhuǎn)錄組、特別是非CpG島Open sea區(qū)域DNA甲基化的改變模式和意義。方法:本研究共納入129例新發(fā)GBM成年患者(≥18歲)的腫瘤組織樣本和6例接受手術(shù)治療的慢性癲癇患者的非腫瘤腦組織對(duì)照樣本。所有組織樣本均來(lái)自于法國(guó)雷恩第一大學(xué)附屬雷恩與安格爾醫(yī)院神經(jīng)外科中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤生物樣本庫(kù),病例收集于2004年1月至2013年12月。所有組織樣本的收集及入庫(kù)均符合法國(guó)生物樣本收集標(biāo)準(zhǔn)及赫爾辛基宣言要求,并取得相應(yīng)患者的知情同意書(shū)。所有納入的GBM病例均接受替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)標(biāo)準(zhǔn)同步放、化療。組織樣本的全基因組DNA甲基化和基因表達(dá)水平的檢測(cè)工作分別由美國(guó)Illumina公司的Infinium HumanMethylation27k/450k芯片平臺(tái)和Agilent公司的Whole Genome 4×44K芯片平臺(tái)完成。另外,本研究亦納入來(lái)自腫瘤基因組圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表達(dá)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中不同病例系列的各級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本。Illumina甲基化芯片中所有基因(蛋白編碼或非蛋白編碼)相關(guān)的探針納入后續(xù)分析。差異甲基化位點(diǎn)和差異表達(dá)基因分別由wilcoxon和標(biāo)準(zhǔn)t檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。我們定義GBM特征性改變的甲基化位點(diǎn)符合腫瘤與非腫瘤組織的中位β差值≥0.2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate,FDR)≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)。Pearson關(guān)聯(lián)分析用于評(píng)估基因甲基化與表達(dá)譜數(shù)據(jù)間的關(guān)聯(lián)程度。我們定義甲基化依賴(lài)的基因表達(dá)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)為Pearson系數(shù)的絕對(duì)值≥0.3且P≤0.05。研究采用從訓(xùn)練到驗(yàn)證的建模思路,建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。生物信息學(xué)分析主要包括基因簇富集分析(Gene Set Enrichment analysis,GSEA)和基因功能注釋聚類(lèi)分析(DAVID)。主成分分析(Principal components analysis,PCA)用于比較不同病理級(jí)別或不同組織類(lèi)型間膠質(zhì)瘤樣本的DNA甲基化模式。不同組間頻數(shù)的差異由卡方或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較。Log-rank檢驗(yàn)用于比較不同組間總體生存期(Overall survival,OS)的差異,Kaplan-Meier法用于計(jì)算患者生存率,所有檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn),P≤0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析軟件均采用R軟件。結(jié)果:我們一共篩選出801個(gè)CpG位點(diǎn)作為GBM特征性甲基化位點(diǎn)的代表,這些位點(diǎn)在納入分析的4組病例組中的至少3組中符合腫瘤特征性甲基化位點(diǎn)的定義。其中399個(gè)CpG位點(diǎn)在GBM中發(fā)生超甲基化改變,402個(gè)位點(diǎn)發(fā)生低甲基化改變。PCA分析結(jié)果支持上述CpG位點(diǎn)的可靠性。通過(guò)分析這些CpG位點(diǎn)在GBM中甲基化水平的改變模式與其CpG島距離定位關(guān)系之間的分布特征,我們發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)(97%)CpG島內(nèi)的CpG位點(diǎn)在腫瘤中發(fā)生超甲基化改變,而這一比例隨著位點(diǎn)與相鄰CpG島之間的距離的增加而下降,只有75%的Shore區(qū)域內(nèi)的CpG位點(diǎn)和37%的Shelf區(qū)域內(nèi)的CpG位點(diǎn)在腫瘤中發(fā)生超甲基化改變。然而對(duì)于距離CpG島最遠(yuǎn)的Open Sea區(qū)域內(nèi)的CpG位點(diǎn),只有7%發(fā)生超甲基化改變。換句話(huà)說(shuō),非CpG島Open Sea區(qū)域內(nèi)的CpG位點(diǎn)絕大多數(shù)(93%)在GBM中發(fā)生低甲基化改變�；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析表明:非CpG島Open sea區(qū)域相關(guān)的基因,相對(duì)于那些CpG島及CpG島鄰近區(qū)域相關(guān)的基因,其發(fā)生腫瘤相關(guān)的差異表達(dá)和DNA甲基化依賴(lài)的基因表達(dá)的概率顯著降低。患者總體生存期關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn):在所有預(yù)后相關(guān)的CpG點(diǎn)中,幾乎所有(96-100%)來(lái)自CpG島區(qū)域的位點(diǎn)的DNA甲基化均與患者生存數(shù)據(jù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。相反,幾乎所有(96-100%)來(lái)自非CpG島Open Sea區(qū)域的位點(diǎn)的DNA甲基化與患者生存時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn):對(duì)應(yīng)于CpG島區(qū)域位點(diǎn)的眾多基因中,主要富集與發(fā)育和轉(zhuǎn)錄過(guò)程相關(guān)的基因,而對(duì)應(yīng)于非CpG島Open Sea區(qū)域位點(diǎn)的基因中,主要富集與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。接下來(lái)我們建立了一組基于8個(gè)免疫基因相關(guān)的非CpG島Open Sea區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程。具體方程如下:風(fēng)險(xiǎn)分值=(-1.07×cg02833180探針的β值)+(-3.06×cg09238677探針的β值)+(-1.89×cg18343292探針的β值)+(-1.54×cg18854666探針的β值)+(-1.65×cg18881723探針的β值)+(-3.44×cg25511807探針的β值)+(-1.93×cg26066361探針的β值)+(-1.65×cg22502502探針的β值)。我們計(jì)算出最佳分組界值為-5.17(約為所有訓(xùn)練組樣本風(fēng)險(xiǎn)分值的第40%分位數(shù))。生存分析表明,甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程在不同的病例組中均能夠穩(wěn)定、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的生存期。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明,甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程是獨(dú)立的預(yù)后指示因子。GSEA分析提示:甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程的分組與不同的表達(dá)譜免疫表型密切相關(guān):高風(fēng)險(xiǎn)組樣本富集免疫功能相關(guān)的基因簇,說(shuō)明這些腫瘤具有免疫異常激活的表型。我們還發(fā)現(xiàn):在GBM中發(fā)生特征性改變的甲基化位點(diǎn)在較低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Lower grade glioma,LGG)中也同樣發(fā)生改變,只是程度不同。與非腫瘤腦組織相比,各級(jí)別膠質(zhì)瘤中CpG島區(qū)域位點(diǎn)的整體DNA甲基化程度明顯增高,而在不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤之間,CpG島區(qū)域位點(diǎn)的整體DNA甲基化程度變化趨于平緩;相反,非CpG島Open Sea區(qū)域位點(diǎn)的整體DNA甲基化水平在LGG與非腫瘤腦組織之間的差異程度并不明顯,但隨著病理級(jí)別的升高,該區(qū)域內(nèi)的DNA甲基化程度顯著降低,尤以GBM為甚。最后,甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程在LGG中也與患者預(yù)后和表達(dá)譜免疫表型密切相關(guān)。結(jié)論:本研究從組學(xué)水平上探討基因非CpG島Open sea區(qū)域DNA低甲基化在GBM中的臨床和生物學(xué)意義。我們發(fā)現(xiàn):與基因CpG島超甲基化相似,非CpG島Open sea區(qū)域DNA低甲基化改變也是GBM中特征性發(fā)生的表觀遺傳學(xué)分子改變,提示其在GBM分子診斷中具有潛在價(jià)值。與CpG島和CpG島相鄰區(qū)域比較,非CpG島Open sea區(qū)域內(nèi)的DNA甲基化改變對(duì)基因表達(dá)水平的影響相對(duì)有限。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)了基因非CpG島Open sea區(qū)域DNA甲基化與患者生存期之間廣泛存在的正相關(guān)關(guān)系,提示其在GBM預(yù)后評(píng)估中的重要意義。我們所建立的基于8個(gè)免疫基因相關(guān)的Open sea區(qū)域低甲基化的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程就是一個(gè)具有潛在實(shí)用價(jià)值的GBM預(yù)后評(píng)估工具。該甲基化評(píng)分方程與免疫表型之間的密切關(guān)系提示其在腫瘤表觀遺傳學(xué)和免疫治療中可能具有指導(dǎo)價(jià)值。不同表觀遺傳學(xué)區(qū)域的DNA甲基化在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮了不同的作用,CpG島的DNA超甲基化改變很可能主要與膠質(zhì)瘤發(fā)病過(guò)程相關(guān),而非CpG島Open sea區(qū)域的DNA低甲基化改變則有可能主要在膠質(zhì)瘤進(jìn)展惡化過(guò)程中發(fā)揮作用。綜上所述,本研究首次從組學(xué)水平上著重強(qiáng)調(diào)了基因非CpG島Open sea區(qū)域DNA低甲基化改變?cè)谀z質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用,未來(lái)還需要更多的研究來(lái)關(guān)注該區(qū)域內(nèi)DNA甲基化改變?cè)谀[瘤生物學(xué)中的重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41
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本文編號(hào)：2502652