【摘要】：肝癌是全球第五大腫瘤疾病,具有極高的發(fā)病率及致死率。目前雖然在臨床上主要采取化學療法、切除法、肝移植、免疫療法等多種方法治療肝癌,但是在發(fā)達國家,肝癌疾病的生存率僅為3-5%,這促使人們不得不繼續(xù)尋找新的治療肝癌疾病的方法。雙環(huán)醇(4,4’-二甲氧基-5,6,5’,6’-雙(亞甲二氧基)-2-羥甲基-2’-甲氧羰基聯(lián)苯)為抗肝炎化學合成新藥,在臨床上已被廣泛應用于治療HBV感染。此外,一些研究證明雙環(huán)醇還具有提高肝功能、保護肝臟免受化學物毒害的作用；同時也有研究發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇可以誘導肝癌細胞中熱休克蛋白HSP27/70的表達,從而抑制細胞線粒體途徑的凋亡。但是,對雙環(huán)醇的抗腫瘤效果以及雙環(huán)醇在腫瘤細胞周期與自噬方面功能的研究仍少有涉及,而相關文獻中對雙環(huán)醇作用后的癌細胞進行高通量篩選差異表達基因等初步研究表明雙環(huán)醇具有作為抗癌藥物的潛能。因此本研究重點探索了雙環(huán)醇對HepG2細胞的毒性作用,并且在體外和體內環(huán)境探究了雙環(huán)醇對肝癌細胞作用的分子機制。結果如下：1.雙環(huán)醇顯著抑制HepG2細胞增殖,而對正常肝細胞LO2的毒性很低。MTT實驗表明,雙環(huán)醇對HepG2的IC50值為LO2細胞的三分之一。而通過流式細胞術研究發(fā)現(xiàn),雙環(huán)醇對HepG2細胞活性的抑制作用主要源于其能夠抑制細胞周期以及誘導細胞產(chǎn)生自噬,而在雙環(huán)醇作用下的HepG2的凋亡水平?jīng)]有發(fā)生變化。在細胞周期方面,雙環(huán)醇能夠誘導HepG2細胞發(fā)生時間和濃度梯度依賴的G1期細胞阻滯。在細胞自噬方面,經(jīng)過雙環(huán)醇處理后,細胞內自噬標志蛋白LC3Ⅰ向LC3 Ⅱ轉化。另外,通過熒光顯微鏡對GFP-RFP-LC3轉染細胞的觀察和透射電鏡直接觀察顯示,細胞內自噬小體和自噬溶酶體的數(shù)量在雙環(huán)醇誘導處理后顯著增加。這些結果說明雙環(huán)醇通過抑制細胞周期和誘導細胞自噬,來抑制HepG2的細胞活性。2.雙環(huán)醇同時抑制PI3K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路。通過western blotting方法,證明雙環(huán)醇影響了G1期調控相關蛋白的活性。雙環(huán)醇能夠誘導p21CIP1和p27KIP1表達,抑制CDK2-cyclinE和CDK4-cyclinD復合體水平,將Rb蛋白去磷酸化導致細胞周期阻滯于G1期,同時本課題還發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇通過抑制mTOR蛋白活性誘導了細胞自噬。通過進一步研究周期與自噬相關上游信號通路,發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇顯著抑制了AKT蛋白的磷酸化,下調了PI3K/AKT通路。轉染AKTcDNA使雙環(huán)醇對腫瘤細胞的周期抑制和自噬誘導效果降低,而轉染AKT siRNA或加入化學抑制劑LY294002分別使雙環(huán)醇的抑瘤作用加強。這些結果表明AKT在雙環(huán)醇抑制腫瘤細胞活性過程中發(fā)揮重要的作用。另外,Ras/Raf/MEK/ERK通路也被雙環(huán)醇所抑制。轉染ERK siRNA或加入化學抑制劑PD98059也分別使雙環(huán)醇周期抑制及自噬誘導效果增強。以上結果說明雙環(huán)醇的細胞毒性效果與PI3K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路有密切關系。3.通過裸鼠移植瘤模型研究雙環(huán)醇在體內環(huán)境的作用。利用腋下移植方法將HepG2細胞移植于裸鼠,通過口服給藥雙環(huán)醇與索拉非尼。結果表明,雙環(huán)醇減小了小鼠體內的腫瘤體積并且降低了腫瘤的重量,同時對小鼠不產(chǎn)生毒性。HE染色和TUNEL染色方法表明在腫瘤組織中雙環(huán)醇引起了腫瘤細胞一定程度的死亡,而在肝組織中沒有發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對腫瘤組織進行western blotting和免疫組化實驗,發(fā)現(xiàn)雙環(huán)醇降低了腫瘤組織內的AKT和ERK磷酸化水平,抑制了蛋白活性。綜上所述,雙環(huán)醇對于腫瘤細胞的抑制增殖作用來源于細胞周期抑制與細胞自噬。在體外和體內環(huán)境中,雙環(huán)醇的毒性與其對PI3K/AKT通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路的抑制作用有關。這些結果使人們對雙環(huán)醇的藥物效果有了更深的理解,為發(fā)展新的抗腫瘤藥物奠定了一定的理論基礎。
[Abstract]:Hepatocellular carcinoma is the fifth largest tumor in the world and has a very high morbidity and mortality. Although a variety of methods such as chemotherapy, excision, liver transplantation, and immunotherapy have been used to treat the liver cancer, the survival rate of the liver cancer is only 3-5% in the developed countries, which has prompted the people to continue to find new methods of treating the liver cancer. Bicyclol (4,4 '-dimethoxy-5,6,5',6 '-bis (methylenedioxy) -2-hydroxymethyl-2'-methoxyphenyl) is a new drug for anti-hepatitis chemical synthesis, and has been widely used in the treatment of HBV infection. In addition, some studies have shown that the bicyclol also has the function of improving the liver function, It is also found that the double-ring alcohol can induce the expression of the heat shock protein HSP27/70 in the liver cancer cell, thereby inhibiting the apoptosis of the mitochondrial pathway of the cell. The anti-tumor effect of the double-ring alcohol and the study of the function of the double-ring alcohol in the cell cycle and autophagy of the tumor are still rare, The preliminary study on the high-throughput screening of differentially expressed genes in the cancer cells after the double-ring alcohol in the relevant literature shows that the double-ring alcohol has the potential as an anti-cancer drug, and therefore, the research focuses on the toxic effect of the bicyclol on the HepG2 cells, And the molecular mechanism of the double-ring alcohol on the action of the liver cancer cells is explored in the in vitro and in vivo environment, and the results are as follows:1. the double-ring alcohol can obviously inhibit the proliferation of the HepG2 cells, and the toxicity to the normal liver cells LO2 is very low. The IC50 value of bicyclol on HepG2 cells is one-third of the LO2 cell, and by flow cytometry it is found that the inhibitory effect of bicyclol on the activity of HepG2 cells is mainly due to its ability to inhibit cell cycle and to induce autophagy of the cells, and the level of apoptosis of HepG2 cells under the action of the bicyclol is not changed. In the aspect of the cell cycle, the double-ring alcohol can induce the G1 phase cell block which is dependent on the time and the concentration gradient of the HepG2 cells, In addition, the observation of GFP-RFP-LC3 transfected cells and the direct observation of transmission electron microscope (TEM) of GFP-RFP-LC3 were observed by fluorescence microscope. The number of autophagy bodies and autophagy lysosomes in the cells increased significantly after the double-ring alcohol induction treatment. These results indicated that the double-ring alcohol inhibited the cell activity of HepG2 by inhibiting the cell cycle and the autophagy of the cells.2. The bicyclol inhibited the PI3K/ AKT pathway and the Ras/ Raf/ MEK/ ERK pathway at the same time. The double-ring alcohol can induce the expression of p21CIP1 and p27KIP1, inhibit the level of CDK2-cyclinE and CDK4-cyclinD complex, and dephosphorylation of Rb protein results in cell cycle arrest in G1 phase. At the same time, it was found that the double-ring alcohol induced autophagy of the cell by inhibiting the activity of mTOR protein. By further studying the upstream signal path of the cycle and autophagy, it was found that the double-ring alcohol significantly inhibited the phosphorylation of the AKT protein. The PI3K/ AKT pathway was downregulated. The effect of Bicyclol on the cycle inhibition and autophagy of the tumor cells was reduced by the transfection of AKTcDNA. The results show that AKT plays an important role in the inhibition of tumor cell activity. The results indicated that the cytotoxicity of the double-ring alcohol was closely related to the PI3K/ AKT pathway and the Ras/ Raf/ MEK/ ERK pathway. The effect of the alcohol in the in vivo environment is that the HepG2 cells are transplanted to a nude mouse by an underarm transplantation method, and the bicyclol and sorafenib are administered by oral administration. The results show that the bicyclol reduces the tumor volume in the mice and reduces the weight of the tumor, The method of HE staining and TUNEL staining showed that the double-ring alcohol in the tumor tissue caused a certain degree of death of the tumor cells, and no similar phenomenon was found in the liver tissue. Western blotting and immunohistochemistry were performed on the tumor tissues. In conclusion, the inhibition and proliferation of the bicyclol on the tumor cells is derived from cell cycle inhibition and autophagy. In vitro and in vivo environment, The toxicity of the double-ring alcohol is related to the inhibition of the PI3K/ AKT pathway and the Ras/ Raf/ MEK/ ERK pathway.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2476390