發(fā)布時間：2019-04-29 14:51

【摘要】：第一部分SIAH2在急性T淋巴細胞白血病骨髓單個核細胞中的定位與表達及與臨床指標關(guān)系的研究目的:研究泛素連接酶Seven-in-Absentia Homolog 2(SIAH2)在急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)骨髓單個核細胞中的定位與表達水平,分析SIAH2表達水平與T-ALL臨床指標的關(guān)系,初步探討SIAH2與T-ALL臨床表現(xiàn)的關(guān)系。方法:收集2011年11月至2015年6月35例初診急性T淋巴細胞白血病及對照組10例新診特發(fā)性血小板減少癥(ITP)患兒骨髓,采用細胞免疫熒光檢測T-ALL、ITP骨髓單個核細胞(BMMNCs)及Jurkat細胞中SIAH2的定位與表達;采用熒光定量PCR(q RT-PCR)方法檢測T-ALL及ITP BMMNC中SIAH2 m RNA的表達情況;應(yīng)用細胞免疫組化方法檢測T-ALL及ITP BMMNCSIAH2蛋白的表達情況;并對SIAH2m RNA表達水平與臨床指標作相關(guān)性分析。結(jié)果:1)細胞免疫熒光顯示,T-ALL BMMNCs及Jurkat細胞胞漿中均可見高亮均勻顆粒狀染色的紅色熒光,ITP BMMNCs中幾乎未見紅色熒光表達;2)免疫組化結(jié)果顯示在初診T-ALL患兒BMMNCs中SIAH2蛋白陽性表達率為71.4%(25/35),與對照組相比P0.05);3)q RT-PCR結(jié)果顯示在初診T-ALL患兒BMMNCs中SIAH2基因表達水平顯著高于對照組(P0.05);4)SIAH2基因表達水平與T-ALL患兒發(fā)生髓外臟器浸潤(EMI)密切相關(guān)(P0.05),尤其是與縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸腔積液的發(fā)生緊密相關(guān)(P值均0.05),而與年齡、性別、初診時白細胞計數(shù)、染色體異常、基因異常、潑尼松誘導(dǎo)緩解及臨床危險度分級無顯著相關(guān)。結(jié)論:SIAH2的表達水平在初診T-ALL患兒BMMNCs中呈高表達,與T-ALL患兒初診時髓外臟器浸潤的發(fā)生密切相關(guān),尤其是與縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸腔積液的發(fā)生緊密相關(guān),提示SIAH2在T-ALL的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。第二部分慢病毒靶向干擾SIAH2基因?qū)urkat細胞株生物學(xué)行為調(diào)控作用及機制研究目的:通過慢病毒干擾技術(shù),研究干擾SIAH2基因的表達對Jurkat細胞株增殖、凋亡及侵襲能力的調(diào)控作用及機制。方法:實驗分組:1)實驗組:靶向干擾SIAH2基因慢病毒(Lv-sh SIAH2)轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞株;2)空白對照組:Jurkat細胞株;3)陰性對照組:陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞株;采用CCK-8法檢測三組Jurkat細胞株的增殖;應(yīng)用流式細胞學(xué)檢測三組Jurkat株的細胞周期;采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法結(jié)合流式細胞儀檢測三組Jurkat細胞株的凋亡;應(yīng)用Transwell檢測三組Jurkat細胞株侵襲能力的情況;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測三組Jurkat細胞株上清中VEGF蛋白的表達水平;采用q RT-PCR、Western-blot方法檢測SIAH2、P27、Cyclin E1、CDK2、c-myc、BCL2、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、MMP-9、MMP-13基因和蛋白表達水平的變化,從基因和蛋白水平觀察慢病毒靶向干擾SIAH2基因的表達對Jurkat細胞株中SIAH2基因的干擾的效果,以及干擾SIAH2基因的表達后三組Jurkat細胞株中周期相關(guān)分子、凋亡相關(guān)分子及侵襲相關(guān)分子的表達水平的變化。結(jié)果:1)q RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示,Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天,SIAH2基因和蛋白表達水平均明顯下降,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;2)CCK-8法結(jié)果顯示,Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第4天時,Jurkat細胞的增殖受到抑制,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天時,Jurkat細胞的增殖顯著受到抑制,與空白對照組和陰性對照組相比P0.001;3)流式細胞學(xué)測細胞周期結(jié)果顯示,Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第八天,Jurkat細胞中處于G0/G1期細胞比例升高,處于S期細胞比例下降,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;4)Annexin V-PE/7-AAD雙染法結(jié)合流式細胞儀測細胞凋亡結(jié)果顯示,Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天,Jurkat細胞的早期凋亡率明顯增加,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;5)Transwell結(jié)果顯示,Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第八天,穿過Transwell系統(tǒng)小室的Jurkat細胞數(shù)量明顯下降,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05。6)EIASA結(jié)果顯示,Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天,細胞上清中VEGF蛋白表達量顯著降低,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05。7)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天,與增殖相關(guān)的蛋白中,P27基因和蛋白表達明顯升高,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;c-myc、Cyclin E1的基因和蛋白表達明顯降低,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;CDK2基因和蛋白的表達無明顯變化,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;8)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天,其與凋亡相關(guān)的分子中Caspase3蛋白表達水平明顯升高,BCL2的基因和蛋白水平明顯下降,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;9)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天,其與侵襲相關(guān)的分子中VEGF、VEGFR2、MMP-13的基因和蛋白的表達明顯降低,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;VEGF、VEGFR1、MMP-13基因和蛋白的表達無明顯變化,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;結(jié)論:1)干擾SIAH2基因的表達后能抑制Jurkat細胞的增殖,將Jurkat細胞DNA阻滯在G0/G1期,可能的機制是由于SIAH2基因的干擾上調(diào)了P27的基因和蛋白表達水平,同時下調(diào)c-myc、cyclin E1的基因和蛋白表達水平,抑制與cyclin E-CDK2復(fù)合物的結(jié)合,使細胞周期停滯于G0/G1期;2)干擾SIAH2基因的表達能促進Jurkat細胞的早期凋亡,其機制可能是SIAH2基因的干擾上調(diào)了Caspase3的蛋白表達水平,同時下調(diào)BCL2的基因和蛋白水平,促進Jurkat細胞通過線粒體凋亡途徑凋亡;3)干擾SIAH2基因的表達能使Jurkat細胞的侵襲能力下降,可能的機制是SIAH2基因的干擾下調(diào)了VEGF、VEGFR2、MMP-13基因和蛋白表達水平,阻斷血管新生和細胞外基質(zhì)降解的重要環(huán)節(jié)。第三部分慢病毒靶向干擾SIAH2基因?qū)urkat細胞株P(guān)HD/HIF-1通路影響的研究目的:通過慢病毒干擾技術(shù),研究干擾SIAH2基因的表達對Jurkat細胞株P(guān)HD/HIF-1通路影響。方法:實驗分組:1)實驗組:靶向干擾SIAH2基因慢病毒(Lv-sh SIAH2)轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞株;2)空白對照組:Jurkat細胞株;3)陰性對照組:陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞株;分別在正常氧濃度與1%氧濃度條件下培養(yǎng)各組細胞48小時后,采用q RT-PCR、Western-blot方法檢測SIAH2基因和蛋白的表達水平,從基因和蛋白水平觀察靶向干擾SIAH2基因慢病毒對SIAH2基因干擾的效果,采用Western-blot方法檢測SIAH2、PHD1/2/3、HIF-1α蛋白的表達水平以觀察干擾SIAH2基因表達后在正常氧濃度與1%氧濃度條件下培養(yǎng)的三組Jurkat細胞中全蛋白中PHD1/2/3和HIF-1α的變化以及核蛋白中HIF-1α的變化。結(jié)果:1)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染Jurkat細胞第8天時,SIAH2基因和蛋白表達水平均明顯下降,與空白對照組和陰性對照組相比P0.05;2)空白對照組和陰性對照組在1%氧濃度條件下培養(yǎng)48小時后SIAH2、HIF-1α的基因表達水平均無明顯變化,與在正常氧濃度條件下相應(yīng)兩組相比P0.05,空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比無明顯差異(P0.05);3)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染第6天的Jurkat細胞,在1%氧濃度、正常氧濃度條件下培養(yǎng)48小時,SIAH2的基因表達水平均顯著降低,與空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比P0.05;HIF-1α的基因表達水平均無顯著變化,與空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比P0.05,SIAH2、HIF-1α的基因表達水平在相應(yīng)條件下相應(yīng)兩組之間相比無顯著差異(P0.05)。4)空白對照組和陰性對照組在1%氧濃度條件下培養(yǎng)48小時后SIAH2的蛋白表達水平顯著升高,PHD1/2/3的蛋白水平明顯降低,HIF-1α的蛋白表達水平均顯著升高,與正常氧濃度條件下相應(yīng)兩組相比P0.05,空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比無明顯差異(P0.05);5)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染第6天的Jurkat細胞,在1%氧濃度、正常氧濃度條件下培養(yǎng)48小時,SIAH2蛋白表達水平均下降,PHD1/2/3的蛋白水平均升高,HIF-1α的蛋白表達水平均顯著降低,與空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比P0.05;SIAH2、PHD1/2/3、HIF-1α的蛋白表達水平在相應(yīng)條件下相應(yīng)兩組之間比無明顯差異(P0.05)。6)空白對照組和陰性對照組在1%氧濃度條件下培養(yǎng)48小時后,核蛋白中,HIF-1α的蛋白表達水平顯著升高,與正常氧濃度條件下相應(yīng)兩組相比P0.05,空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比無明顯差異(P0.05);7)Lv-sh SIAH2轉(zhuǎn)染第6天的Jurkat細胞,在1%氧濃度、正常氧濃度條件下培養(yǎng)48小時,核蛋白中,HIF-1α的蛋白表達水平顯著降低,與空白對照組和陰性對照組在相應(yīng)條件下兩組相比P0.05,HIF-1α的蛋白表達水平在1%氧濃度、正常氧濃度條件下兩組之間無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1)低氧條件下,SIAH2、HIF-1α蛋白的表達上調(diào),PHD蛋白的表達下調(diào),可能的機制是低氧抑制了SIAH2的自降解過程,使其在細胞內(nèi)積聚,與PHD的特異性結(jié)合增多,進而加速PHD的泛素化降解,從而導(dǎo)致HIF-1α不能充分有效的被PHD羥基化,HIF-1α穩(wěn)定性增加而在細胞內(nèi)蓄積,促進HIF-1α轉(zhuǎn)位入核,最終激活其下游基因的轉(zhuǎn)錄;2)在1%氧濃度、正常氧濃度條件下,干擾SIAH2基因的表達后均能夠上調(diào)PHD蛋白的表達,下調(diào)HIF-1α蛋白的表達,可能的機制是SIAH2基因的干擾,使其編碼的SIAH2的蛋白減少,進而使PHD的泛素化降解減少,從而促進了HIF-1α的羥基化以破壞了HIF-1α的穩(wěn)定性,加速HIF-1α經(jīng)泛素化降解,引起HIF-1α入核減少,最終抑制其下游基因的轉(zhuǎn)錄;3)在Jurkat細胞中,SIAH2主要是從蛋白水平調(diào)控PHD、HIF-1α的表達激活PHD/HIF-1信號通路,影響細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jia-Ling Zhong;Chang-Zhi Huang;;Ubiquitin proteasome system research in gastrointestinal cancer[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2016年02期

，

本文編號：2468310