【摘要】：研究背景原發(fā)性肝癌是來(lái)源肝臟上皮組織的惡性腫瘤,是全球第五位最常見(jiàn)的癌癥和第三位最常見(jiàn)的癌癥死因,全世界每年約有63萬(wàn)肝癌新發(fā)病例而超過(guò)半數(shù)的新病例發(fā)生在中國(guó)[1],目前,外科切除和肝移植仍是最有效治療早期階段肝癌的方法,盡管如此,患者五年內(nèi)手術(shù)部位復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[2],而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因。嚴(yán)格的手術(shù)指征,肝臟捐贈(zèng)者的限制和高昂的成本造成肝移植只適用于少數(shù)患者。近年來(lái),隨著高通量、高分辨的成像及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA lnc RNA)與疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的密切相關(guān)性逐漸顯現(xiàn),尤其是lnc RNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控效應(yīng)備受關(guān)注[3-5]。lnc RNA廣泛存在于真核生物的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中,一般長(zhǎng)度為200bp-100kb,缺乏開(kāi)放式閱讀框,不能編碼蛋白質(zhì),起初甚至被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)錄噪音”[6-8],近年來(lái),對(duì)lnc RNA的研究逐漸取得進(jìn)展,有越來(lái)越多的證據(jù)表明lnc RNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)我們采用基因芯片技術(shù)在肝癌組織中篩選出一個(gè)肝癌相關(guān)新基因名為UC00lkfo,其長(zhǎng)度為2043bp,基因編碼區(qū)與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actinα-SMA)的編碼基因ACTA2發(fā)生部分重疊,應(yīng)用基因組瀏覽器和RNAplex預(yù)測(cè)ACTA2為UC001kfo的靶基因,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)UC001 kfo和α-SMA在肝癌組織較癌周組織中表達(dá)顯著性升高,并且在不同侵襲能力肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量不同。后在人肝癌組織及細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上利用RT-PCR、原位雜交、免疫組化和細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明UC001kfo是具有調(diào)節(jié)功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移�？傊�,前期實(shí)驗(yàn)表明UC001kfo的靶基因?yàn)锳CTA2,靶蛋白為α-SAM,UC001kfo與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了更進(jìn)一步分析UC001kfo與α-SAM的相互作用機(jī)制,我們已經(jīng)采用si RNA干擾技術(shù)下調(diào)UC001kfo的表達(dá),RT-PCR的方法檢測(cè)了α-SAM的m RNA表達(dá),采用Western Blot的方法檢測(cè)了α-SAM的蛋白表達(dá),結(jié)果兩者顯著相關(guān),從m RNA和蛋白水平分別驗(yàn)證下調(diào)UC001kfo后α-SAM的表達(dá)減少[9].α-SMA是肌動(dòng)蛋白的一種,后者以單體和多聚體形式存在。單體的肌動(dòng)蛋白即球狀肌動(dòng)蛋白(globular actin,G-actin)。肌動(dòng)蛋白的多聚體形成肌動(dòng)蛋白絲即纖維狀肌動(dòng)蛋白(fibros actin,F-actin),肌動(dòng)蛋白至少表達(dá)成6種異構(gòu)形式,根據(jù)等電點(diǎn)的不同,將其分為分為α、β、γ三類(lèi),α分布于各種肌肉細(xì)胞中,其中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白參與細(xì)胞形態(tài)的維持,參與構(gòu)成真核細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu),是構(gòu)成細(xì)胞骨架和收縮構(gòu)件的主要成分,肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚參與細(xì)胞骨架的重塑,影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng),因此,α-SMA是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)[10]。另外,a-SMA是肝癌相關(guān)肌纖維母細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts CAF)的重要細(xì)胞成分,在肝癌細(xì)胞旁分泌機(jī)制作用下,癌旁組織成纖維細(xì)胞(paired peritumoral tissue fibroblasts PTF)表達(dá)a-SMA向CAF表型分化,結(jié)果PTF發(fā)生遷移和侵襲[11]。研究表明a-SMA、鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)還可促使上皮細(xì)胞-間充質(zhì)(epithelialmesenchymal transition,EMT)改變[12],而EMT能夠通過(guò)特定程序?qū)⑸掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞,如使細(xì)胞失去極性、獲得較高的降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等,EMT主要參與生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[13],以細(xì)胞黏附分子表達(dá)的減少,細(xì)胞骨架中波形蛋白(Vimentin)、平滑肌蛋白表達(dá)增加以及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等為主要特點(diǎn)[14-15],是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的重要生物學(xué)過(guò)程[16-17]�？傊�,α-SAM通過(guò)細(xì)胞骨架重塑,構(gòu)成微絲和EMT的發(fā)生影響細(xì)胞遷移,是增強(qiáng)肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái),研究者對(duì)細(xì)胞核骨架的研究取得很大進(jìn)展,成為細(xì)胞生物學(xué)研究的一個(gè)新的生長(zhǎng)點(diǎn),細(xì)胞核骨架是相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)骨架而言,兩者共同構(gòu)成細(xì)胞骨架,核骨架與DNA的復(fù)制、RNA的轉(zhuǎn)錄和加工、染色體的組裝密切相關(guān)。肌動(dòng)蛋白存在于細(xì)胞核中已被證明,可能的原因之一是由胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,雖然肌動(dòng)蛋白是眾所周知的在細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)行為中發(fā)揮職能,但新興的研究在強(qiáng)調(diào)肌動(dòng)蛋白的新角色,一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞核活動(dòng)中的功能,肌動(dòng)蛋白作為核部件之一,有它自己的結(jié)構(gòu)和功能的規(guī)則,比如與核基質(zhì),染色質(zhì)重塑,轉(zhuǎn)錄和m RNA加工相關(guān)[18]。因此,α-SAM似乎參與核轉(zhuǎn)錄調(diào)控,可能對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。本次研究采用過(guò)表達(dá)和si RNA干擾技術(shù)通過(guò)UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達(dá),使細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)生改變,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,同時(shí)使肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT;研究UC001kfo對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控效應(yīng)。目的1.采用lnc RNA過(guò)表達(dá)和si RNA干擾技術(shù)通過(guò)UC001kfo調(diào)控α-SMA的表達(dá),使細(xì)胞骨架形態(tài)發(fā)生改變,探討該基因?qū)Ω伟┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。2.探討UC001kfo對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。3.探討UC001kfo對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。方法以肝癌細(xì)胞株Hep G2為細(xì)胞模型,在37℃5%CO2滅菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),適時(shí)傳代;實(shí)驗(yàn)分組為上調(diào)實(shí)驗(yàn):p CDNA3.1-UC001kfo(實(shí)驗(yàn)組)、p CDNA3.1(陰性對(duì)照組)、Hep G2(空白組);下調(diào)實(shí)驗(yàn):UC001kfo-si RNA(實(shí)驗(yàn)組)、NC-si RNA(陰性對(duì)照組)、Hep G2(空白組),每組三個(gè)復(fù)孔;p CDNA3.1-UC001kfo載體前期實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建;采用脂質(zhì)體(參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū))轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):熒光拍照檢測(cè)NC-siRNA-FAM的轉(zhuǎn)染;RT-qpCR檢測(cè)UC001kfo和α-SMA的表達(dá);免疫組化檢測(cè)細(xì)胞骨架的變化;Transwell小室實(shí)驗(yàn),細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移能力;MTT和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組定量資料比較采用t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1 RT-q PCR檢測(cè)UC001kfo和SMA的表達(dá)量(1)UC001kfo:48h后UC001kfo表達(dá)量UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為1924.14±238.69、1.87±0.43、1.00±0.29、0.01±0.00、0.85±0.25。(2)α-SMA:48h后α-SMA表達(dá)量UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為6.81±1.39、0.82±0.14、1.00±0.54、0.59±0.04、1.47±0.15。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn)(1)UC001kfo:48h后UC001kfo表達(dá)量UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。(2)α-SMA:48h后α-SMA表達(dá)量UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。下調(diào)實(shí)驗(yàn)(1)UC001kfo:h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)(2)α-SMA:UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。2免疫組化IA值48h UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為972.53±59.10、623.11±57.66、697.98±51.29、399.03±64.47、633.94±44.44。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn):UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);下調(diào)實(shí)驗(yàn):UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為213±16.17、96±4.58、128±3.21、28±9.64、80±4.04;轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為201±19.09、97±5.69、116±11.53、40±3.79、72±10.21。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-p CDNA組分別與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-p CDNA組分別與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。下調(diào)實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染48h后UC001kfo-si RNA組分別與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);轉(zhuǎn)染96h后UC001kfo-si RNA組分別與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24h:遷移率(%)UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為32.56±5.56、31.05±7.12、35.77±7.28、25.72±5.13、32.59±3.74;距劃痕48h:UC001kfo-p CDNA組、p CDNA組、Hep G2組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為63.57±5.58、63.41±6.04、56.77±7.54、40.76±4.74、54.76±0.57;距劃痕72h:UC001kfo-pCDNA組、pCDNA組、HepG2組、UC001kfo-siRNA組、NC-si RNA組分別為98.34±2.88、87.90±0.83、92.43±2.19、、60.98±1.41、80.34±1.05。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染48h后距劃痕24h UC001kfo-p CDNA組分別與Hep G2組和p CDNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);距劃痕48h UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組和p CDNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);距劃痕72h UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組和p CDNA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。下調(diào)實(shí)驗(yàn):距劃痕24h UC001kfo-si RNA組分別與Hep G2組和NC-si RNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);距劃痕48h UC001kfo-si RNA組與Hep G2組和NC-si RNA組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);距劃痕72h UC001kfo-si RNA組與Hep G2組和NC-si RNA組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。5 MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化1.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示:24h時(shí)pcDNA3.1-UC001kfo組、HepG2組、pCDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為0.72±0.02、0.67±0.04、0.71±0.02、0.56±0.04、0.7±0.02;48h時(shí)p CDNA-UC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為1.22±0.07、1.03±0.03、1.09±0.04、0.8±0.03、0.97±0.07;96h時(shí)p CDNA-UC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為1.63±0.07、1.39±0.07、1.47±0.03、1.05±0.04、1.38±0.02。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn):24h UC001kfo-p CDNA組分別與Hep G2組和p CDNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);48h時(shí)UC001kfo-p CDNA組與p CDNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);96h時(shí)UC001kfo-p CDNA組與p CDNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);UC001kfo-p CDNA組與Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);下調(diào)實(shí)驗(yàn):24h UC001kfo-si RNA組分別與Hep G2組和NC-si RNA組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);48h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);UC001kfo-si RNA組與Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。96h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。2.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:48h時(shí)克隆集落形成率(%)p CDNAUC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為34.94±4.24、25.73±2.32、26.80±1.91、13.20±0.92、24.40±2.31;96h時(shí)p CDNA-UC001kfo組、Hep G2組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為40.93±4.41、30.40±5.14、25.80±3.67、13.60±1.83、22.73±1.62。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn):48h時(shí)UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。96h時(shí)UC001kfo-p CDNA組與p CDNA組和Hep G2組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);下調(diào)實(shí)驗(yàn):48h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01);96h UC001kfo-si RNA組與NC-si RNA組和Hep G2組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。6流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化轉(zhuǎn)染48h后Hep G2組、p CDNA-UC001kfo組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為3.5±2.36、6.3±1.15、3.7±2.76、3.83±2.46、3.53±2.28,轉(zhuǎn)染96h后Hep G2組、p CDNA-UC001kfo組、p CDNA組、UC001kfo-si RNA組、NC-si RNA組分別為3.12±0.58、4.97±1.16、4.03±1.04、2.3±0.56、3.6±1.78。T-test結(jié)果:上調(diào)實(shí)驗(yàn):48h、96h p CDNA-UC001kfo組分別與p CDNA組、Hep G2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);下調(diào)實(shí)驗(yàn):48h、96h p CDNA-si RNA組分別與si RNA組、Hep G2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。結(jié)論1.UC001kfo通過(guò)調(diào)控a-SMA促進(jìn)肝癌細(xì)胞偽足形成,細(xì)胞骨架增多,更易于肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),進(jìn)而促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移,同時(shí)發(fā)生上皮-間質(zhì)改變。2.UC001kfo促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。3.UC001kfo未參與肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王萍;楊金鳳;張慶;承澤農(nóng);于東紅;;RhoC基因的過(guò)量表達(dá)在胃癌中的意義[J];臨床消化病雜志;2007年02期

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本文編號(hào)：2462156