【摘要】：當今世界,盡管分子成像諸如FDG-_正電子發(fā)射斷層掃描(FDG-PET)顯著地提高了肺癌的診斷率,但肺癌仍是癌癥相關性死亡的主要病因之一。根據(jù)肺癌的生物學特性和治療方法,可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌,非小細胞肺癌占多數(shù),包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細胞癌等,治療多采用手術為主的綜合治療。因此認識非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的發(fā)生發(fā)展機制,對于提前預防和發(fā)病后的治療具有重要的意義。HIWI是眾所周知的人類PIWI家族的RNA沉默基因,在干細胞中能發(fā)揮自我更新的重要作用。大量的DNA修復因子存在于機體細胞中,同時因不同類型DNA損傷,而在機體中扮演著特異的修復角色,核苷酸切除修復系統(tǒng)是基因修復的一個重要途徑,其中切除交叉修復基因1(Excision repair cross complementing geng1,ERCC1)在修復系統(tǒng)中起著一個連接損傷識別及切割的作用。當前,有關ERCC1與NSCLC之間關系的報道很少。因此主要研究HIWI和ERCC1基因在NSCLC組織中的表達情況,探討HIWI對肺癌細胞的生長是否有促進作用；檢測ERCC1的表達水平,分析HIWI及ERCC1表達與NSCLC患者臨床特征的關系,探討其在預后等方面的價值,為臨床研究提供依據(jù)。第一部分HIWI表達水平調控對人類非小細胞肺癌細胞增殖的影響目的：通過評估HIWI在NSCLC標本中的過表達和HIWI對A549細胞生長的影響,揭示HIWI在NSCLC細胞生長中有重要作用,為研究新的抗癌療法潛在靶標提供依據(jù)。方法：1.實驗材料：隨機選取經病理診斷為非小細胞肺癌癌組織57例為實驗組,癌旁試樣從腫瘤邊緣距離之10毫米選取作為對照組(全部是在患者進行化療和放療前術中切除),立即在-80-C液氮中冷凍并儲存,前瞻性記錄所有標本的臨床資料；同時在體外構建非小細胞肺癌A549細胞系。 2.RNA的提取和實時半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測腫瘤內、癌旁標本和A549細胞中HIWI在mRNA水平上的表達。3.免疫印跡分析法(Western blot analysis)分析腫瘤樣本中HIWI蛋白水平表達,用細胞裂解試劑將非小細胞肺癌的標本均質并使其受蛋白質的分離,所有的蛋白質樣品通過10%的SDS-PAGE凝膠分離并轉移至緩沖鹽水中進行定量分析。4.A549細胞中HIWI表達的調控：為了在A549細胞中過表達HIWI,擴增野生HIWI編碼序列和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉錄成一個mRNA序列,并翻譯成兩個獨立的蛋白質,HIWI-2A-EGFP-的pcDNA3.1(+)或控制的CAT-2A-EGFP-的pcDNA3.1 (+)載體通過用脂質體2000轉染到A549細胞,所述HIWI和EGFP陽性細胞克隆,A549 HIWI (+)或CAT和EGFP陽性細胞克隆并檢測細胞敲除HIWI表達。5.細胞計數(shù)法、CCK-8法和集落形成分析細胞計數(shù)。結果：1.HIWI在非小細胞肺癌標本中過表達：①通過RT-qPCR對非小細胞肺癌組織中HIWI mRNA表達進行了研究,結果表明了癌組織顯著高于癌旁組織(均數(shù)差值0.7642,95%CI=0.5695-0.9590；R2=0.5249；P0.01：見圖1A)；②免疫印跡檢測顯示癌組織HIWI蛋白水平的表達明顯高于癌旁組織(P0.01：見圖1B)。2.HIWI過表達促進A549細胞增殖：①構建A549HIWI (+)細胞和A549對照細胞的生長曲線(見圖2A),克隆并分揀出GFP(+)細胞(見圖2B)同時HIWImRNA(見圖2C)和蛋白(見圖2D)高表達細胞；②CCK-8細胞計數(shù)分析表明,A549 HIWI(+)的細胞增殖從24至96小時比A549對照細胞更迅速(P0.001和p0.01；見圖3A)；③然后我們在順鉑的存在下重復了該實驗,與A549對照組相比,A549HIWI(+)組細胞的增值率顯著增高(24 h：p0.05和48h：p0.01；見圖3B)；④A549HIWI(+)細胞和A549對照細胞之間的生長差異再次被克隆形成實驗證實了,在24或48小時后,A549 HIWI(+|)細胞比A549對照細胞形成更多菌落(P0.01；見圖3C/3D)。因此,我們證實了HIWI過表達對非小細胞肺癌A549細胞的增殖在體外也有促進作用。3.siRNAs敲除HIWI從而阻止HIWI過表達對A549細胞增殖的促進作用,我們用RNA干擾法重新評價了HIWI過表達對A549細胞的增殖的促進作用：①我們用HIWI特異性siRNA破壞了HIWI在A549 HIWI (+)細胞中的表達,與siRNA-con轉染的細胞相比,siRNA-HIWI或siRNA-HIWI2轉染后mRNA和蛋白水平中HIWI表達都顯著降低(P0.01；見圖4A/B)；②siRNA敲除HIWI對肺癌細胞增殖的影響：CCK-8細胞計數(shù)分析表明,siRNA-HIWI1或siRNA-HIWI2轉染的細胞增殖顯著降低(分別在24小時轉染后P0.05,分別在48小時轉染后P0.01,見圖4C)；③克隆形成實驗還表明,與siRNA-con組相比,菌落在siRNA-HIWI1和siRNA-HIWI2兩者中的形成顯著減少(P0.01；見圖4D/E)。因此,我們再次通過功能喪失的方法確認了HIWI過表達對非小細胞肺癌A549細胞的增殖有促進作用。結論：1. HIWI mRNA和蛋白在人類非小細胞肺癌的癌組織中表達均高于癌旁組織；2.通過功能增益和功能喪失確定了HIWI對體外非小細胞肺癌細胞的生長有促進作用：3. HIWI可能對非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展有促進作用。第二部分非小細胞肺癌組織HIWI和ERCC1的表達及臨床聯(lián)系目的：檢測HIWI及ERCC1在人類非小細胞肺癌中的表達水平,分析其表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的關系,并探討其在預后等方面的價值,為臨床研究提供珍貴依據(jù)。方法：1.病例選擇：收集行完全性手術切除且經過病理確診的非小細胞肺癌組織標本共42例,所選組織標本均經過切片審核及復核,需要依據(jù)資料的完整性及隨訪情況,確定資料的完整。選擇國際抗癌聯(lián)盟1997版修訂的非小細胞肺癌分期標準為依據(jù),參考術前影像學以及術后病理資料確定入選病例臨床分期為Ⅰ-Ⅲa期,其中Ⅰ a-b期18例,Ⅱ a-b期11例,Ⅲa期1 3例。所選患者生存期為(7-76)個月,平均生存期為(35.6+1.5)個月。2. HIWI和ERCC1表達檢測：對42例非小細胞肺癌患者手術切除標本予以S-P法進行HIWI和ERCC1表達的檢測,染色定位主要是在細胞核,選定陽性細胞著色強度以及陽性細胞在同類細胞數(shù)中的百分比來進行半定量結果判定,0分用(-)表示,1-3分表示為弱陽性,可用(+)表示,3-8分為中度陽性(++)表示,9-12分為強陽性,用(+++)表示,依據(jù)實驗切片、HE染色片以及陰性對照片來對結果進行判定,最后進行復核,(++)以上方定義為陽性表達。3.研究了HIWI和ERCC1表達與肺癌瘤體大于5cm、瘤體分葉、瘤體毛刺征、器官受累及肺門縱隔淋巴結腫大的關系。4.所得統(tǒng)計學數(shù)據(jù)根據(jù)臨床分期、組織病理學類型、年齡結構、性別、預后等進行分組比較。5.HIWI和ERCC1進行相關性分析。結果：1.42例患者中,HIWI陽性表達率為55.6%.ERCC1為45.24%,且發(fā)現(xiàn)二個因子表達水平與患者年齡、性別、吸煙、及病理情況無顯著相關性(P0.05),而與臨床分期有關(P0.01)。 2.本組中共42例非小細胞肺癌患者,生存期為7-76個月,平均生存期為(35.6±1.5)個月。①ERCC1陽性表達者19例,平均生存期為(25.44±1.2)個月；ERCC1陰性表達者23例,其平均生存期為(45.1±2.3)個月,通過統(tǒng)計學處理顯示,ERCC1陽性表達與陰性表達者的生存期有著明顯的差異,陰性表達者優(yōu)于陽性表達者(P=0.003)；② HIWI陽性表達者23例,平均生存期為26.2個月；ERCC1陰性表達者23例,其平均生存期為45.1個月,通過統(tǒng)計學處理顯示,ERCC1陽性表達與陰性表達者的生存期有著明顯的差異,陰性表達者優(yōu)于陽性表達者(P=0.003)。3.HIWI與ERCC1的表達呈正相關,相關系數(shù)為0.841。4.非小細胞性肺癌瘤體大于5cm、瘤體分葉、瘤體毛刺征、器官受累及肺門縱隔淋巴結腫大中,除了肺門縱隔淋巴結腫大外HIWI和ERCC1陽性表達均遠大于陰性表達,差異就有統(tǒng)計學意義。結論：1.HIWI和ERCC1在非小細胞肺癌中有一定表達,陽性表達率分別為45.24%和55.6%,表達水平與年齡、性別、吸煙情況以及病理類型無明顯關聯(lián),而與臨床分期有關；2.在非小細胞肺癌中,HIWI和ERCC1陰性表達者的平均生存期優(yōu)于陽性表達者,可以作為預后判斷指標；3.非小細胞肺癌中HIWI和ERCC1的表達呈正相關。
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【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
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2446288
