【摘要】：卵巢惡性腫瘤占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第六位,是女性癌癥的第七大死因。上皮性卵巢癌(以下簡稱卵巢癌)(Epithelial Ovarian Cancer, EOC)是其中最常見的組織類型,是女性惡性腫瘤死亡的首要原因。在全世界,每年新發(fā)現(xiàn)卵巢癌204000例,因卵巢癌死亡125000例。卵巢癌是高度侵襲性的惡性腫瘤,有超過70%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于Ⅲ期或Ⅳ期,其5年生存率分別為35%和20%。卵巢癌的擴散主要表現(xiàn)為腹腔內(nèi)廣泛播散和種植。盡管在EOC的研究方面已經(jīng)取得了巨大的進步,但卵巢癌的發(fā)病機制尚屬醫(yī)學研究的盲區(qū)。因此,闡明卵巢癌的發(fā)病和侵襲轉(zhuǎn)移機制,發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標記物和分子治療靶點,已成為目前攻克卵巢癌亟待解決的關鍵問題。上皮細胞性惡性腫瘤通常是通過淋巴道或血道播散,而EOC卻有異于此傳播方式。EOC傳播的特點如下：(1)卵巢癌細胞的主要傳播方式是直接蔓延,即在腹膜腔內(nèi)擴散,淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生較晚,血行傳播少見；(2)卵巢癌細胞在形態(tài)學和分子學上發(fā)生了一系列改變,從而能夠適應與腹膜內(nèi)基質(zhì)和間皮組織的接觸,這些改變即為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,簡稱EMT,是指在各種內(nèi)外因素的影響下,隨著E-cadherin的表達下調(diào),上皮細胞之間的粘附降低,同時,上皮樣形態(tài)的細胞逐漸向間質(zhì)樣細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變,繼而使細胞運動性增加、侵襲轉(zhuǎn)移能力增強的過程。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),WAVE1與上皮性卵巢癌(EOC)的不良預后密切相關,很有可能成為EOC的獨立預后分子。我們課題組通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)WAVE1的表達后,發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞SKOV3的侵襲轉(zhuǎn)移及增殖均受到抑制。此外,我們還發(fā)現(xiàn)WAVE1的上游信號分子c-Abl也與EOC的不良預后有關。有大量文獻顯示,racl是WAVE1的另一個上游信號分子,它可以使WAVE1磷酸化而被激活,rac1/wave1信號通路在細胞運動中起著重要的作用。Rac1 (ras-related C3 botulinum toxin substrate 1),又稱ras相關的C3肉毒素底物1,是Rho家族中Rac亞家族中的一員。Rac1基因全長29kb,位于人染色體7p22,包含7個外顯子。Rac1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有2種,分別為1.2kb和2.5kb。Rac1基因編碼產(chǎn)物是一個鳥苷酸(GTP)結(jié)合蛋白,分子量約為20-25kD,通過與GTP核苷酸的水解和結(jié)合,該蛋白可在無活性的Rho GDP和有活性的Rho GTP之間轉(zhuǎn)換,從而激活下游不同的信號通路產(chǎn)生不同的作用。近年來,有多篇文獻顯示,racl在胃癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中有異常增高。Rac1參與細胞運動、增殖和凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學過程,促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Racl在多種腫瘤的EMT過程中也起著重要的作用。然而racl與EOC發(fā)展與預后的關系及在EOC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用尚未見明確報道。本研究在前期研究的基礎上,探討rac1在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)中的作用及其機制,以期闡明卵巢癌EMT機制,為干預卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)。第一部分Racl在上皮性卵巢癌中的表達及其臨床意義目的檢測racl在不同卵巢組織標本中的表達情況,探討racl的表達與EOC臨床病理特征的關系。方法(1)采用免疫組織化學方法分析24例正常卵巢組織,41例良性上皮性卵巢腫瘤組織,21例交界性上皮性卵巢腫瘤組織和150例EOC組織標本中rac1的蛋白表達情況,分析racl的表達與EOC各臨床病理參數(shù)之間的關系。(2)采用Western blot方法檢測正常卵巢組織標本18例,良性上皮性卵巢腫瘤組織標本28例,交界性上皮性卵巢腫瘤組織11例和EOC組織標本43例中rac1的蛋白表達情況,分析racl的表達與EOC各臨床病理參數(shù)之間的關系。(3)應用Kaplan-Meier法分析racl的表達與EOC患者生存時間的關系；Cox回歸分析研究影響EOC生存時間的因素。(4)采用qRT-PCR和Western blot方法檢測人卵巢癌細胞株SKOV3、OVCAR-3、3A為、ES-2中rac1 mRNA和蛋白的表達,應用免疫熒光染色觀察rac1在卵巢癌細胞株中的細胞定位。結(jié)果(1)免疫組織化學染色的結(jié)果顯示：在150例EOC患者中,racl均呈陽性表達,其中83例(55.3%)呈高表達,67例(44.7%)呈低表達。76.2%(16例/21例)的交界性卵巢組織、87.8%(36例/41例)的良性卵巢組織、95.8%(23例/24例)的正常卵巢組織中,racl呈不表達或低表達。因此,rac1的表達水平在EOC中明顯增高,與交界性卵巢組織、良性卵巢組織、正常卵巢組織相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。Rac1的表達水平與血清CA125水平、臨床分期、病理分級和術(shù)后殘留腫瘤體積有明顯相關性(P0.01),但與患者年齡、腹水量、腫瘤的組織學類型以及腫瘤的大小及部位無明顯相關性(P0.05)。(2) Western blot檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rac1的表達水平在EOC組織中明顯高于交界性卵巢組織、良性卵巢組織、正常卵巢組織(分別為1.810-0.390,0.543±-0.277,0.389±0.188和0.384±0.150),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在43例新鮮EOC標本中,rac1的表達水平與血清CA125水平、臨床分期、病理分級和術(shù)后殘留腫瘤體積有明顯相關性(P0.01),但與患者年齡、腹水量、腫瘤的組織學類型以及腫瘤的大小及部位的相關性不大(P0.05)。(3)Racl低表達組的5年生存率明顯高于racl高表達組(P0.001),且無瘤生存時間明顯延長(P0.001)。COX分析顯示：與患者不良預后有關的因素為racl的高表達,腫瘤分期的中晚期和病理分級的低分化。(4)Racl在卵巢癌細胞株中的表達情況為：qRT-PCR結(jié)果顯示,SKOV3、OVCAR3、3AO、ES2中rac1 mRNA的表達均較高,分別為：2.207±0.251,1.870±0.207,0.983±0.097,0.818±0.150。Western blot結(jié)果與qRT-PCR基本一致,SKOV3、OVCAR3、3A0、ES2中racl的表達為：1.256±0.156,1.370±0.060,0.724±0.0802,0.850±0.142。免疫熒光染色結(jié)果顯示,rac1定位于卵巢癌細胞的細胞膜和細胞漿。結(jié)論(1)Rac1在EOC患者標本和卵巢癌細胞株中均為高表達。(2)Rac1的高表達與血清CA125水平、臨床分期、病理分級和術(shù)后殘留腫瘤體積呈正相關。(3)Racl與EOC不良預后有關,有可能成為EOC的獨立預后分子,在EOC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。第二部分Rac1基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞株的篩選目的構(gòu)建rac1 shRNA'慢病毒載體,轉(zhuǎn)染至卵巢癌細胞株SKOV3與OVCAR3中。篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌株并進行鑒定,為后續(xù)研究rac1在卵巢癌EMT中的作用奠定基礎。方法(1)設計并合成兩條含高效特異性靶向人racl基因的racl shRNA和一條陰性對照。通過雙酶切實驗和DNA序列測序?qū)ζ渲亟M質(zhì)粒進行鑒定。(2)將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒進行慢病毒包裝,轉(zhuǎn)染到293T細胞,收獲上清并濃縮測定滴度。(3)采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染法,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3和OVCAR3中,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。(4)采用Real-time PCR和Western blot方法檢測rac1在各組中mRNA和蛋白的表達,鑒定并獲得rac1基因抑制效率最高的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。結(jié)果(1)設計合成2條rac1 shRNA (rac1 shRNA-1、rac1 shRNA-2)和一條陰性對照,雙酶切法及DNA序列測定顯示構(gòu)建成功。(2)慢病毒載體介導的rac1 shRNA-1、rac1 shRNA-2和陰性對照成功轉(zhuǎn)入SKOV3和OVCAR3,利用嘌呤霉素成功篩選獲得穩(wěn)定抑制rac1表達的SKOV3和OVCAR3細胞株。(3)采用Western blot和Real-time PCR檢測和驗證,得到rac1靶點干擾效果最佳的SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2細胞。結(jié)論(1)成功構(gòu)建了racl shRNA'慢病毒載體及陰性對照。(2)成功篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染racl shRNA慢病毒載體的卵巢癌細胞株及其陰性對照細胞株,并在mRNA和蛋白水平上對轉(zhuǎn)染效果進行了鑒定。(3)成功篩選獲得了racl基因抑制效果最明顯的卵巢癌細胞株SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2,為后續(xù)研究racl在卵巢癌EMT中的作用奠定了基礎。第三部分Racl對上皮性卵巢癌細胞細胞生物學特性的影響目的觀察干擾racl基因表達后,卵巢癌細胞生物學特性的改變,證實racl在卵巢癌細胞中與EMT的關系,為卵巢癌轉(zhuǎn)移提供一個新的研究方向。方法(1)采用劃痕實驗檢測干擾racl基因表達后,SKOV3和OVCAR3細胞遷移能力的改變。(2)采用Transwell侵襲實驗檢測干擾racl基因表達后,SKOV3和OVCAR3細胞侵襲能力的改變。(3)采用粘附實驗檢測干擾racl基因表達后,SKOV3和OVCAR3細胞粘附能力的改變。(4)采用平板克隆實驗檢測干擾racl基因表達后,SKOV3和OVCAR3細胞克隆形成能力的改變。(5)采用BrDU滲入實驗檢測干擾racl基因表達后,SKOV3和OVCAR3細胞增殖能力的改變。(6)采用裸鼠成瘤實驗檢測干擾racl基因表達后,SKOV3和OVCAR3細胞體內(nèi)腫瘤形成能力的改變。結(jié)果(1)干擾rac1表達對卵巢癌細胞遷移侵襲能力的影響劃痕實驗結(jié)果顯示：干擾racl的表達后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,24h后細胞的遷移率明顯降低(P0.05)。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：干擾racl的表達后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,48h后到達小室膜下室面的細胞個數(shù)明顯減少(P0.05)。粘附實驗結(jié)果顯示：干擾racl的表達后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,粘附能力明顯減弱,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)干擾racl表達對卵巢癌細胞增殖能力的影響平板實驗結(jié)果顯示：干擾racl的表達后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,克隆形成數(shù)目明顯減少(P0.05)。BrDU滲入實驗結(jié)果顯示：干擾racl的表達后,SKOV3-Ri1和OVCAR3-R12分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,處于S期的細胞比例明顯減少(P0.05)。裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果顯示：干擾racl的表達后,SKOV3-Ri1與SKOV3-NC相比,移植瘤生長速度減慢,腫瘤體積明顯減小(P0.05)。結(jié)論(1)抑制rac1的表達,卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖能力受到抑制。(2)Racl可能與卵巢癌EMT過程有關,可能成為治療卵巢癌,改善預后的潛在靶點。第四部分Rac1對上皮性卵巢癌細胞分子生物學特性的影響目的干擾racl的表達后,上皮細胞標記物(如E-cadherin)與間質(zhì)細胞標記物(如Vimentin)是否發(fā)生了改變,為rac1在卵巢癌EMT中的作用尋找分子生物學證據(jù)；研究rac1表達下調(diào)后可能引起的卵巢癌細胞通路的變化,明確rac1引起卵巢癌細胞功能改變的分子機制。方法(1)HE染色觀察干擾racl表達后,裸鼠移植瘤中卵巢癌細胞形態(tài)改變。(2)免疫組織化學染色觀察干擾rac1表達后,裸鼠移植瘤中E-cadherin、vimentin蛋白表達的變化。(3) Western blot檢測干擾rac1表達后,卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3中E-cadherin、vimentin蛋白表達的變化。(4) Western blot檢測干擾racl表達后,卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3中pakl、p-pak1、p38 MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的變化。結(jié)果(1)HE染色結(jié)果顯示：SKOV3-NC組細胞排列紊亂,大小不一,極性消失,可見較多病理性核分裂像；SKOV3-Ri1組細胞排列較整齊,大小較一致,細胞中病理性核分裂像少見。(2)免疫組織化學染色結(jié)果顯示：裸鼠移植瘤中,與SKOV3-NC組比較,SKOV3-Ri1組E-cadherin的表達上調(diào),vimentin的表達下調(diào)(P0.05)。(3) Western blot結(jié)果顯示：卵巢癌細胞中,分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2細胞中E-cadherin的表達明顯上調(diào),vimentin的表達明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4) Western blot結(jié)果顯示：卵巢癌細胞中,分別與SKOV3-NC和OVCAR3-NC相比,SKOV3-Ri1和OVCAR3-Ri2細胞中pak1、p-pak1、 p-p38MAPK的表達明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而p38MAPK的表達并無明顯改變(P0.05)。結(jié)論(1)Rac1影響腫瘤EMT相關分子的表達,調(diào)節(jié)EOC的EMT過程。(2)Racl可能通過racl/pakl和p38 MAPK信號通路發(fā)揮生物學作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：2446109