【摘要】：目的腸癌是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要疾病之一。腸癌的主要癌前疾病是腸道腺瘤(約占全部腸癌癌前疾病的90%~95%),腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,Apc)的突變普遍被認(rèn)為是腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的早期事件。臨床發(fā)現(xiàn),高脂飲食可導(dǎo)致肝臟合成膽汁酸的底物(膽固醇)增加,進(jìn)而引發(fā)腸腔中膽汁酸流量增加,過(guò)量的膽汁酸無(wú)法全部在回盲部通過(guò)腸肝循壞回吸收,而是會(huì)有部分進(jìn)入結(jié)腸。最新研究還發(fā)現(xiàn)高脂飲食可誘導(dǎo)腸道菌群失衡,引起多種顯著的腸道菌群豐度改變及機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂。初級(jí)膽汁酸膽酸(cholic aicd,CA)是人類(lèi)最主要膽汁酸之一,一方面,其代謝受到腸道菌群的影響,另一方面,其代謝產(chǎn)物也影響著腸道菌群,而腸道菌群與膽汁酸的相互作用在腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不完全明確。本研究以能自發(fā)形成腸道腺瘤的Apcmin/+小鼠為模型,探討在腸道腺瘤惡變過(guò)程中膽汁酸與腸道菌群的相互作用。方法第一部分:為了探討CA對(duì)Apcmin/+小鼠腸道腺瘤惡變的作用,我們以4周齡Apcmin/+小鼠為研究對(duì)象,分為膽酸組(飲食中添加0.4%CA)和對(duì)照組(普通飲食),飼養(yǎng)周期為12周,處死小鼠,分離全部腸道組織,分段記錄腺瘤數(shù)量及大小,病理學(xué)評(píng)估腺瘤惡變情況;Realtime-PCR、免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠腸道單核-巨噬系統(tǒng)改變;免疫組織化學(xué)觀察腺瘤惡變過(guò)程中Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)的變化。第二部分:飼養(yǎng)12周后,處死小鼠前給予小鼠FITC-D灌胃,采取眼球血檢測(cè)血清FITC-D濃度以評(píng)價(jià)腸道通透性,收集新鮮糞便進(jìn)行腸道菌群16S r RNA測(cè)序及色譜法檢測(cè)各種膽汁酸水平;處死小鼠,采取回盲部糞便色譜法檢測(cè)短鏈脂肪酸水平;Realtime-PCR、免疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)腸道緊密連接蛋白、杯狀細(xì)胞及潘氏細(xì)胞功能;Realtime-PCR檢測(cè)腸道炎癥水平。第三部分:為評(píng)價(jià)抗生素去除腸道菌群對(duì)CA誘導(dǎo)Apcmin/+小鼠腸癌的阻斷作用,我們對(duì)膽酸組小鼠同時(shí)給予抗生素雞尾酒(萬(wàn)古霉素100mg/L、氨芐西林200mg/L、新霉素200mg/L和甲硝唑200mg/L)以去除腸道菌群作用,余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理同上,此時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為三組:膽酸組,膽酸+抗生素組,對(duì)照組,12周后處死小鼠,計(jì)數(shù)腸道腺瘤數(shù)目及大小,病理學(xué)組織學(xué)觀察腺瘤惡變情況,RealtimePCR檢測(cè)腸道炎癥。第四部分:為深入研究膽酸及其導(dǎo)致的腸道菌群改變對(duì)IL-6/STAT3信號(hào)通路的影響,我們應(yīng)用Realtime-PCR、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)以上三組IL-6/STAT3通路關(guān)鍵信號(hào)分子的變化;同時(shí)為進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè),我們以結(jié)腸癌前細(xì)胞系IMCE為研究對(duì)象,Western blot方法探索IL-6/STAT3通路及其下游關(guān)鍵分子的變化。結(jié)果第一部分(1)實(shí)驗(yàn)周期12周后膽酸組小鼠腸道腫瘤數(shù)量明顯增加約2倍,腫瘤數(shù)量增多主要出現(xiàn)在中段和遠(yuǎn)段小腸,小腸各種大小的腺瘤均增加(1mm,1-2mm,2mm),大腸大腺瘤數(shù)量增多。此外,病理學(xué)染色顯示CA組小鼠腸道腺瘤發(fā)生惡變,在遠(yuǎn)端小腸,80%出現(xiàn)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變,而對(duì)照組僅為腺瘤伴或不伴有低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。Apcmin/+膽酸組小鼠腸道腫瘤Ki-67及β連環(huán)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)膽酸組Apcmin/+小鼠巨噬細(xì)胞招募顯著增加,腸道腫瘤組織間質(zhì)巨噬細(xì)胞的M2型表面分子比例增多,而M1型表面分子比例減少,提示組織存在惡性轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。(3)膽酸上調(diào)Apcmin/+小鼠Wnt通路,腸組織E-cadherin和β-catenin表達(dá)情況與對(duì)照組相比存在顯著差異,E-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)減少,β-catenin在細(xì)胞漿中表達(dá)增加且部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核的濃集,Cyclin D1在細(xì)胞漿中的表達(dá)亦增加。第二部分(1)CA誘導(dǎo)腸道微生態(tài)失衡,具體表現(xiàn)為致病菌(如普沃氏菌屬、埃希志賀菌屬、脫硫弧菌屬,還包括一些條件致病菌,如Akkermansia、Bacteroides等菌屬)明顯增加,益生菌(如乳桿菌、雙歧桿菌、產(chǎn)丁酸菌等)明顯減少,同時(shí)CA致使小鼠腸道菌群多樣性發(fā)生明顯降低。(2)膽酸組Apcmin/+小鼠回盲部短鏈脂肪酸(包括乙酸、丙酸、丁酸)的水平明顯低于對(duì)照組。(3)Apcmin/+膽酸組小鼠血清FITC-D濃度明顯高于對(duì)照組,提示膽酸處理Apcmin/+小鼠會(huì)使其腸道通透性明顯增加。同時(shí),膽酸組緊密連接蛋白ZO-1、Claudin3、Claudin7的m RNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,PAS染色、MUC 2、defensin、cryptdin免疫組化染色及基因表達(dá)提示CA導(dǎo)致杯狀細(xì)胞及潘氏細(xì)胞功能受損。(4)膽酸組Apcmin/+小鼠腸道發(fā)生低度炎癥,實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示小鼠腸道上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6及TNF-α相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高。(5)膽酸組Apcmin/+小鼠腸道膽汁酸水平明顯高于對(duì)照組,主要表現(xiàn)為進(jìn)食性DCA水平的增加。第三部分(1)試驗(yàn)周期12周后,膽酸+抗生素組Apcmin/+小鼠腸道腺瘤數(shù)目及大小較膽酸組明顯降低,病理組織學(xué)顯示膽酸+抗生素組小鼠腸道腫瘤均為管狀腺瘤,惡性度低于膽酸組和對(duì)照組。(2)膽酸+抗生素組Apcmin/+小鼠腸道炎癥水平較膽酸組和對(duì)照組相比大幅降低。第四部分(1)小鼠腸道組織免洗組織化學(xué)染色顯示,小鼠腸道IL-6、STAT3、p-STAT3表達(dá)明顯增加。(2)膽酸組小鼠糞菌液刺激IMCE細(xì)胞系,炎癥因子水平增加,上調(diào)IL-6/STAT3通路信號(hào)分子及其下游關(guān)鍵分子。結(jié)論本文揭示了膽汁酸與腸道菌群的相互作用對(duì)腸道腺瘤進(jìn)展過(guò)程的影響,一些可能與腸道炎癥相關(guān)的細(xì)菌,如Akkermansia,等可能是促發(fā)腺瘤惡變過(guò)程的因素之一,此外,腸道中保護(hù)性SCFAs水平的降低,膽汁酸水平的增加及STAT3等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的活化等均參與其中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.3

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本文編號(hào)：2425545