【摘要】：胃癌是全球第四大最常見的惡性腫瘤,我國的發(fā)病率則明顯高于全球平均水平。由于胃癌患者無特異性的早期癥狀,近一半的胃癌患者在被診斷時已經(jīng)進(jìn)展到晚期,預(yù)后較差。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及一系列癌基因的激活和抑癌基因的失活。篩查這些基因并研究其作用機(jī)制對于胃癌的早期診斷和治療具有重要的價(jià)值。 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein-3, IGFBP3)是IGFBP家族的主要組成成分,主要通過和循環(huán)中的I型胰島素樣生長因子(IGF-I)結(jié)合而發(fā)揮作用。既往研究表明,IGFBP3在多種腫瘤中表達(dá)異常,主要影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過程,對侵襲轉(zhuǎn)移的報(bào)道則較少。同源盒基因D10(homeobox D10, HoxD10)可以編碼轉(zhuǎn)錄因子,我們的既往研究發(fā)現(xiàn)HoxD10可以影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移侵襲等行為。通過基因表達(dá)譜芯片篩選發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞中,包括IGFBP3在內(nèi)的多個基因可能受到HoxD10的調(diào)節(jié)。因此,我們推測IGFBP3可能作為轉(zhuǎn)錄因子HoxD10的下游靶點(diǎn),影響胃癌的生物學(xué)行為。 為證實(shí)此推測,在本研究中,我們通過對胃癌組織芯片進(jìn)行免疫組化檢測,分析胃癌與癌旁IGFBP3蛋白表達(dá)水平的差異及IGFBP3表達(dá)同患者TNM分期和生存期等的相關(guān)性。通過劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn),研究IGFBP3沉默表達(dá)后對胃癌細(xì)胞遷移侵襲的影響,并檢測遷移侵襲相關(guān)因子尋找可能的機(jī)制。通過染色質(zhì)免疫共沉淀和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測,明確了HoxD10蛋白對IGFBP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 研究方法 1.胃癌組織中IGFBP3表達(dá)水平和臨床資料的相關(guān)性分析 (1)IGFBP3抗體對含有胃癌和癌旁配對組織的組織芯片進(jìn)行免疫組化染色,分析癌與癌旁IGFBP3表達(dá)的差異。 (2)分析胃癌組織中IGFBP3的表達(dá)和患者TNM分期、病理分級及生存期等的相關(guān)性。 2. IGFBP3對胃癌細(xì)胞遷移侵襲的作用及可能的機(jī)制 (1)采用劃痕試驗(yàn)、Transwell遷移試驗(yàn)檢測siRNA靶向干擾IGFBP3表達(dá)后,胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901遷移能力的變化。 (2)鋪基質(zhì)膠的Transwell侵襲試驗(yàn)檢測siRNA靶向干擾IGFBP3表達(dá)后,胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901侵襲能力的變化。 (3) RT-PCR和Western blotting檢測siRNA靶向干擾IGFBP3表達(dá)后,遷移侵襲相關(guān)因子表達(dá)水平的變化。 3.胃癌細(xì)胞中HoxD10對IGFBP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 (1)采用RT-PCR, Western blotting和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng),在胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中,檢測HoxD10過表達(dá)后,IGFBP3的mRNA.蛋白質(zhì)及啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化。 (2)利用啟動子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測軟件PROMO預(yù)測IGFBP3啟動子區(qū)域可能和轉(zhuǎn)錄因子HoxD10結(jié)合的位點(diǎn),以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,采用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測能夠募集HoxD10的位點(diǎn)。 (3)采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測鑒定HoxD10的活性結(jié)合位點(diǎn),對核心結(jié)合序列進(jìn)行點(diǎn)突變后再次檢測熒光素酶活性的變化是否被沉默。 研究結(jié)果 1.胃癌組織中IGFBP3表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān) (1)胃癌組織中IGFBP3的表達(dá)顯著低于配對的癌旁組織(p0.01)。 (2) IGFBP3高表達(dá)的患者處在高淋巴結(jié)分期N2+N3的比例顯著低于IGFBP3低表達(dá)的患者(p0.05),清掃出的總淋巴結(jié)中出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的比例亦顯著較低(p0.01)。 (3)IGFBP3高表達(dá)患者4.5年的生存率顯著高于IGFBP3低表達(dá)的患者(p0.01)。 2. IGFBP3抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲 (1)在不同野生胃細(xì)胞株中,HGC27表達(dá)IGFBP3相對最高,BGC823、SGC7901和GES-1表達(dá)次之,AGS、MKN28、MKN45、NCI-N87和MGC803則低表達(dá)。 (2) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,BGC823和SGC7901劃痕的愈合顯著加快,12h和24h的遷移率明顯提高(p0.01)。 (3) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,遷移到Transwell小室下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(p0.01)。 (4) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,穿過基質(zhì)膠侵襲到Transwell小室下層的細(xì)胞明顯增多,下層細(xì)胞洗脫后的OD值顯著增加(p0.01)。 (5) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,MMP14,uPA和uPAR的mRNA表達(dá)量顯著增加。 1.胃癌細(xì)胞中HoxD10在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IGFBP3的表達(dá) (1) pcDNA3.1-HoxD10轉(zhuǎn)染的BGC823和SGC7901中HoxD10的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高,同時伴隨著IGFBP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平的明顯增高。 (2)轉(zhuǎn)染HoxD10后IGFBP3啟動子報(bào)告基因熒光素酶活性顯著增加(p0.01)。PROMO軟件預(yù)測顯示IGFBP3轉(zhuǎn)錄上游2.3kb有5個可能和HoxD10結(jié)合的位點(diǎn)HBS1-5。 (3)以HoxD10抗體沉淀的核酸為模板,HBS3、HBS4和HBS5引物可以擴(kuò)增出明顯條帶；HoxD10過表達(dá)后,HBS3、HBS4或HBS5的報(bào)告基因熒光素酶相對活性均顯著增加(p0.01),突變的HBS3、HBS4和HBS5報(bào)告基因熒光素酶相對活性則無明顯變化。 研究結(jié)論 1.胃癌組織中IGFBP3的表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān),IGFBP3表達(dá)高的患者生存期較長。 2.IGFBP3能顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲,其作用可能和MMP14, uPA/uPAR等因子相關(guān)。 3.HoxD10可以同IGFBP3啟動子區(qū)域的HBS3、HBS4及HBS5結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)IGFBP3的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳紅敏;王莉;張明川;;MUC1和uPA在上皮性卵巢癌中表達(dá)的臨床意義[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2010年03期

2 梁新華,肖貴州,毛祖彝,吳軍樓,何永文;加熱對人舌癌Tca8113細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活物表達(dá)的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年02期

3 王升志,梁新華,成洲,畢洪廣,毛祖彝,王大章;乏氧對人舌癌Tca8113細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活物表達(dá)的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年03期

4 吳桂珠,鄭秀;腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移與uPA系統(tǒng)的關(guān)系[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

5 梁新華,徐平平,毛祖彝,吳軍樓,肖貴州;尿激酶受體在口腔鱗癌中的表達(dá)[J];口腔頜面外科雜志;2002年04期

6 鄭智國;;卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其信號傳導(dǎo)途徑[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2006年01期

7 王大力,王鐵;尿激酶型纖溶酶原激活劑及其特異受體在喉癌中的表達(dá)及意義[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2005年12期

8 王大力;王鐵;任重;;uPA基因啟動子甲基化與喉鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2006年09期

9 王大力;王琰;任重;;喉鱗狀細(xì)胞癌中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶激活與uPA表達(dá)上調(diào)的關(guān)系[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2007年09期

10 詹靈凌;呂小平;李山;姜海行;覃錦耀;唐勁光;;肝硬化患者血漿uPA、uPAR水平與肝纖維化和癌變的相關(guān)性[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2008年02期

相關(guān)會議論文 前8條

1 鄭智國;許沈華;;卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及其信號傳導(dǎo)途徑研究進(jìn)展[A];浙江省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2005年

2 楊帆;王麗;洪斌;;HDAC抑制劑調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Sp1機(jī)制研究進(jìn)展[A];2013年中國藥學(xué)大會暨第十三屆中國藥師周論文集[C];2013年

3 劉璐;;絕經(jīng)后激素治療與卵巢癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（下冊，，墻報(bào)P25-P48）[C];2013年

4 劉敏霞;周可成;曹毅;;新的肺癌相關(guān)基因MCRS1病理生理功能研究[A];第十六屆中國科協(xié)年會——分3環(huán)境污染及職業(yè)暴露與人類癌癥學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2014年

5 肖麗君;趙爽;鄭華川;趙恩宏;鄭鑫;;Parafibromin在胃腸道癌中的表達(dá)及與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系[A];第十六屆中國科協(xié)年會——分13感染、免疫和疫苗論壇論文集[C];2014年

6 付文婷;王科燕;王曉梅;;門診化療臨床藥師服務(wù)的切入點(diǎn)[A];第十三屆全國青年藥師成才之路論壇暨抗腫瘤藥物合理應(yīng)用與臨床藥學(xué)實(shí)踐國家級繼教會議論文集[C];2014年

7 吳天石;王艷杰;郭雋馥;徐寧陽;王榮;金穎;唱云鳳;馬麗娜;;四君子丸對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織增殖及凋亡的影響[A];第四次中華中醫(yī)藥科技成果論壇論文集[C];2014年

8 王芳;趙玲莉;;亞高原西寧地區(qū)腫瘤標(biāo)志物CA72-4、CA24-2、CEA聯(lián)合檢測對胃癌早期診斷的評價(jià)分析[A];中國轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和整合醫(yī)學(xué)研討會（廣州站）論文綜合刊[C];2015年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 林英;高分子納米復(fù)合造影材料研究[D];南京大學(xué);2011年

2 朱秀委;數(shù)學(xué)腫瘤學(xué)的研究與應(yīng)用：微環(huán)境的作用[D];浙江大學(xué);2011年

3 車津晶;基于炭疽毒素與受體相互作用的抗炭疽和抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

4 李國平;環(huán)氧合酶-2促進(jìn)人膀胱移行細(xì)胞癌的血管生成與侵襲能力[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

5 孫興會;尿激酶受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

6 王大力;尿激酶型纖溶酶原激活劑在聲門上型喉癌中的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

7 丁怡;雷公藤甲素抗血管生成的作用及機(jī)理研究[D];四川大學(xué);2005年

8 王寶山;腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及臨床意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2006年

9 李曉冬;TNFα或mmLDL對血管內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1基因表達(dá)的影響及其分子機(jī)制探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

10 鄭欣;一、嗜鉻細(xì)胞瘤基因差異表達(dá)的研究 二、腎上腺髓質(zhì)素對原代培養(yǎng)的人嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中兒茶酚胺水平的影響[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張鵬;uPA、uPAR、PAI-1及maspin在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義[D];鄭州大學(xué);2010年

2 王雪春;uPA合成抑制劑Amiloride對人宮頸癌細(xì)胞體外侵襲遷移及凋亡的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

3 袁蔚;uPA、uPAR及MMP-2在子宮頸鱗癌組織的表達(dá)及臨床意義[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

4 焦珍珍;oxLDL對正常人外周血單個核細(xì)胞LOX-1及uPAR表達(dá)的影響[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

5 唐茂源;UPA和UPAR在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)及意義[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

6 高f;肝癌相關(guān)基因的篩選和功能研究[D];華東理工大學(xué);2011年

7 冷超;Smad4失活和Kras~(G12D)活化對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的協(xié)同效應(yīng)研究[D];華中科技大學(xué);2011年

8 高維強(qiáng);尿激酶受體檢測方法的建立及其臨床應(yīng)用[D];蘇州大學(xué);2001年

9 程波;肺癌中激活蛋白AP-1及其相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2003年

10 凌丹;纖溶酶原激活因子及其抑制因子與卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2004年

本文編號：2421884