【摘要】：前言食管癌(Esophageal cancer)是最常見的消化道腫瘤之一,其典型癥狀表現(xiàn)為進行性咽下困難,根據(jù)病理組織學(xué)分型,食管癌可分為鱗癌、腺癌和腺鱗癌。在所有的惡性腫瘤中,食管癌的致死率居于第六位,盡管隨著腫瘤治療手段的進步,食管癌的5年生存率較30年前有了顯著提高(約4%),達到10%-20%,但其生存率仍處于較低水平。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinomas, ESCC)是最常見的消化道侵襲性惡性腫瘤之一,預(yù)后較差,研究發(fā)現(xiàn)鱗癌與腺癌的生存率之間無明顯差異。目前,治療ESCC的常規(guī)有效的方法主要包括手術(shù)治療、放療及化療,其中手術(shù)治療最為常用。至今為止,盡管多種治療方法已經(jīng)應(yīng)用于ESCC的治療,但其五年生存率仍不能令人滿意。因此,發(fā)現(xiàn)一種可預(yù)測ESCC預(yù)后的生物標志物在ESCC的治療方面將具有重大的意義,并可用于在高危人群中篩查ESCC患者。所以,對ESCC分子機制的研究將有助于對ESCC患者的治療。轉(zhuǎn)化生長因子-β (Transforming growth factor-β, TGF-p)是一種多功能生長因子,主要由腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞、間質(zhì)細胞和腫瘤細胞產(chǎn)生,可作為一種重要的炎癥因子,在維持上皮細胞的穩(wěn)定過程中起著重要的作用,同時對于許多重要的細胞過程也起著重要的調(diào)節(jié)作用,包括細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞分化和細胞外基質(zhì)的合成等過程。TGF-β的一個最主要的作用是抑制細胞增殖,因此TGF-β功能異常與多種腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系,例如結(jié)腸癌、膀胱癌、卵巢癌、。腎癌、淋巴瘤、上皮細胞癌等。在正常的上皮細胞中,TGF-β可誘導(dǎo)G1周期的可逆性停滯,而在上皮細胞癌細胞中,TGF-β的功能明顯被抑制。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β在食管鱗癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用,促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。絲氨酸／精氨酸蛋白激酶(serine-arginine protein kinase, SRPK)是一類能特異性磷酸化RNA剪接子內(nèi)精氨酸-絲氨酸結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶,可與精氨酸-絲氨酸或絲氨酸-精氨酸二肽模體特異性結(jié)合,在細胞的生長發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。在人體內(nèi),SRPK主要分為兩種亞型,即SRPK1及SRPK2,這兩種亞型主要分布在不同的組織器官之中,調(diào)節(jié)絲氨酸-精氨酸蛋白與mRNA前體的特異性結(jié)合,保證細胞的正常功能,同時在細胞周期的調(diào)控過程中也發(fā)揮著重要的作用。SRPK1是真核生物中一種高度保守的蛋白質(zhì),由一個PKC超家族激酶域和一個將該激酶域平均分為兩部分的間隔區(qū)組成。一些研究表明SRPK1在富含絲氨酸／精氨酸序列的蛋白質(zhì)(又稱為RS-域蛋白)的特定氨基酸序列的磷酸化過程中起著重要的作用。RS-域蛋白主要作用于前體mRNA的翻譯、加工、剪切,染色體的重建,細胞周期的調(diào)節(jié)及細胞結(jié)構(gòu)的重構(gòu)等過程。SRPK1的間隔區(qū)可參與SRPK1由細胞質(zhì)到細胞核的轉(zhuǎn)運過程。研究表明,SRPK1表達水平的提高與乳腺癌、肺癌及肝癌的發(fā)生風(fēng)險和預(yù)后有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),SRPK1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長及侵襲、遷移也具有重要的作用。但是SRPK1在腫瘤發(fā)展過程中的具體作用機制仍有待研究。根據(jù)目前的研究結(jié)果,本組認為沉默SRPK1基因的表達在腫瘤的發(fā)展過程中可發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而,到目前為止,TGF-β-SRPK1在ESCC中的確切作用仍不清楚。為探究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細胞癌細胞生物學(xué)過程中的作用和意義,我們應(yīng)用免疫組化法、免疫印跡法及RT-PCR法檢測120例食管鱗狀細胞癌樣本及細胞系中SRPK1的表達水平。并在體外實驗中,檢測加入TGF-β作用后的食管鱗狀細胞癌細胞中的SRPK1的表達水平,從而分析并總結(jié)SRPK1在ESCC組織和細胞中的表達譜及其生物學(xué)作用,著重于探究發(fā)展有效的抗-SRPK1治療方法的臨床價值和優(yōu)勢。第一部分S RPK1在食管鱗癌中的表達及臨床意義目的本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)以及基因和蛋白檢測方法觀察SRPK1在食管癌組織及正常食管組織中的表達,并分析其在食管癌發(fā)生和發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移、病理分級、臨床分期中的關(guān)系,探討SRPK1可能作為致癌基因在食管癌的診斷和治療的臨床價值,為其治療提供新的靶點。材料與方法本實驗選取山東省腫瘤醫(yī)院及山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科自2008年10月至2010年6月收治的120例食管癌病人,病人均經(jīng)過手術(shù)治療,切除的食管癌標本經(jīng)兩名病理科醫(yī)師獨立診斷證實。標本中癌組織作為實驗組,相應(yīng)標本的上切緣組織即距腫瘤5cm以上的正常食管組織作為實驗對照組進行配對分組研究。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測SRPK1蛋白在食管癌組織及與其配對正常組織中表達的差異,探討其在腫瘤演生、進展過程中的作用。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,SRPK1與食管癌臨床病理因素之間的分析采用行卡方檢驗。以a=0.05作為統(tǒng)計學(xué)檢驗水準。結(jié)果：1.SRP K1在ESCC組織中的表達免疫組化染色表明,在120例ESCC組織中,有65例顯示了高SRPK1表達,而在這65例ESCC組織中,SRPK1蛋白主要在細胞質(zhì)和細胞核中表達,其中包括29例(++)和31例(+++)。然而,在癌周正常組織中則很少出現(xiàn)SRPK1染色。此外,SRPK1 mRNA的表達水平在腫瘤組織中明顯增高。與無癌轉(zhuǎn)移的食管組織相比,在有癌轉(zhuǎn)移的ESCC樣本中SRPK1 mRNA及蛋白的表達水平均顯著升高。2. SRPK1與腫瘤臨床病理特點之間的關(guān)系SRPK1的表達與腫瘤臨床分期及腫瘤大小無明顯相關(guān)性。相反,SRPK1的表達量與ESCC的轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性,其差異具有的統(tǒng)計學(xué)意義(p0.001)。3.SRPK1表達水平與ESCC病人預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示SRPK1表達水平與總生存率偏低密切相關(guān)(p0.000)。另外,單因素分析結(jié)果證實,SRPK1高表達的病人發(fā)生死亡的風(fēng)險顯著升高(p0.001)。同時,單因素分析結(jié)果還顯示,ESCC轉(zhuǎn)移性與不良預(yù)后有關(guān),然而,患者的年齡、性別和腫瘤侵襲深度與預(yù)后之間無關(guān)聯(lián)。多因素分析結(jié)果也顯示,SRPK1表達可作為預(yù)測ESCC病人預(yù)后的獨立預(yù)測因子(p0.001)結(jié)論：SRPK1蛋白在食管癌組織中的陽性表達率高于正常食管組織。SRPK1蛋白的陽性表達與臨床分期及腫瘤大小無明顯相關(guān)性,與ESC C的轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性。SRPK1表達水平與總生存率偏低密切相關(guān),且高表達的ESCC患者的死亡風(fēng)險明顯增高,因此,SRPK1的表達可作為預(yù)測ESCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。第二部分SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗癌細胞的增殖和凋亡中的作用目 的：1.研究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細胞癌組織及細胞系的表達水平。2.研究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細胞癌細胞的增殖和凋亡過程中的作用和意義。3.探究SRP K1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細胞癌組織及細胞中的生物學(xué)作用。材料方法：1. SRPK1-WT 及 SRPK1-KD質(zhì)粒和腺病毒載體的構(gòu)建建立人ESCC細胞系EC109、TE8和TE2細胞,以進行相關(guān)的SRPK1的細胞水平檢測。野生型SRPK1 (SRPK1-WT)的全長cDNA通過RT-PCR擴增正常食管上皮細胞mRNA獲得,而SRPK1 (SRPK1-KD)無活性激酶突變體則通過將第109位的賴氨酸催化突變?yōu)楸彼岖@得。隨后,將SRPK1-WT或者SRPK1-KD的cDNA插入pcDNA3.1 (-)A-myc/his表達載體。通過AdEasyTM XL腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒表達SRPK-WT 或 SRPK1-KD。2.抗SRPK1質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA均以脂質(zhì)體2000為載體轉(zhuǎn)入細胞內(nèi),Western blot法檢測轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用Western b lot及RT-PCR方法分別檢測EC109、TE8和TE2細胞系中SRPK1的表達,同時還應(yīng)用、Vestern blot法檢測細胞中AKT和JNK的磷酸化水平,從而評估SRPK1對TGF-β信號通路的潛在作用。3.細胞增殖實驗檢測檢測SRPK1野生型及激酶失活型細胞的生存率,以探究SRPK1對細胞增殖的影響。4.采用TUNEL實驗和免疫印跡方法探究SRPK1對ESCC細胞凋亡的影響。并設(shè)計損傷愈合實驗和侵襲實驗以探究SRPK1在EC109細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過程的作用。5.應(yīng)用流式細胞術(shù)和、Western blot法選擇EC109細胞系來研究SRPK1對細胞周期的調(diào)控作用及對調(diào)控因子的表達的影響。結(jié)果：1.SRPK1在ESCC細胞中的表達在不同的細胞系中SRPK1的表達水平有所不同。SRPK1在TE2細胞系中表達水平最高,在EC109細胞系中表達水平最低。在EC109、TE8和TE2細胞系中,SRPK1主要在細胞膜或者細胞質(zhì)中表達。2. SRPK1影響細胞增殖野生型S RP Kl可增強三種ESCC細胞系細胞的增殖作用,而激酶失活型則可抑制細胞增殖。同時,SRPK1基因沉默可顯著抑制腫瘤細胞增殖。3. SRPK1影響細胞凋亡SRPK1基因敲除的陽性細胞中,活化-caspase3和cyclinD1的表達水平升高,而在對照siRM A組則無增高(p0.01)。同時,經(jīng)si-SRP K1治療后,EC 109細胞可出現(xiàn)凋亡相關(guān)的形態(tài)變化,如細胞萎縮變圓、細胞膜空泡化、細胞核斷裂凝結(jié)等。在TE8和TE2等其他ESCC細胞系中,si-SRPK1作用后的細胞也會出現(xiàn)相同的變化。4. SRPK1調(diào)節(jié)AKT和JNK信號與對照siRNA組相比,在si-SRPK1處理組,磷酸化-AKT在三種ESCC細胞系中的表達水平均顯著降低(p0.01),而磷酸化-JNK的表達水平則明顯增高(p0.01)。5. SRPK1調(diào)控ESCC細胞的細胞周期、轉(zhuǎn)移和侵襲過程EC109細胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的過程受到SRPK1 siRNA的抑制。同時,與對照組相比,ESCC細胞中的cyclin D1和CDK2的表達水平也受到明顯抑制。損傷愈合實驗顯示,SRPK1 siRNA轉(zhuǎn)染后的EC 109細胞的遷移性下降明顯。同樣,在侵襲實驗中,與未轉(zhuǎn)染組相比,SRPK1 siRNA轉(zhuǎn)染后的EC109細胞的侵襲性也受到明顯的抑制(p0.001)。結(jié)論：SRPK1在不同分化水平的ESCC細胞系中的表達水平有所不同,提示SRPK1在ESCC的發(fā)展中有一定的作用,且對細胞信號的起始和轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有一定的影響。SRPK1可通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路的活性來調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡之間的平衡,為TGF-β信號通路的一個重要組成部分。SRPK1亦可調(diào)控ESCC細胞的細胞周期、轉(zhuǎn)移和侵襲過程,作為G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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1 Yu-Lin Sun;Fei Liu;Fang Liu;Xiao-Hang Zhao;;Protein and gene expression characteristics of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1 in esophageal squamous cell carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2016年32期

2 Marina Chianello Nicolau;Luis Felipe Ribeiro Pinto;Pedro Nicolau-Neto;Paulo Roberto Alves de Pinho;Ana Rossini;Tatiana de Almeida Sim?o;Sheila Coelho Soares Lima;;Nicotinic cholinergic receptors in esophagus: Early alteration during carcinogenesis and prognostic value[J];World Journal of Gastroenterology;2016年31期

3 黎增輝;廖愛軍;;JNK信號通路[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2010年03期

4 孫嫣;田華;肖法Z，

本文編號：2420427