發(fā)布時(shí)間：2019-01-16 02:21

【摘要】：肝癌在我國已成為我國惡性腫瘤致死病因的第2位。肝癌早期癥狀不明顯,病情進(jìn)展快,50.5%的新發(fā)肝癌患者出現(xiàn)在中國。目前肝癌的治療主要包括外科手術(shù)切除腫瘤、放療、化療、介入治療、射頻消融治療等,但效果不盡人意,因此預(yù)防肝癌的發(fā)生及改善預(yù)后是目前肝癌研究的熱點(diǎn)。隨著放療技術(shù)的進(jìn)展,放療能夠殺死肝癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)造成周圍組織的損傷,我們?nèi)孕枰谔岣叻暖熋舾行苑矫孀龈顚哟蔚难芯俊AB182又稱TNKS1BP1,是通過酵母雜交實(shí)驗(yàn)研究Tankyrase 1時(shí)被第一次發(fā)現(xiàn),一種參與DNA損傷后修復(fù)的蛋白,能夠與能夠和DNA-Pkcs相互作用,還可以影響DNA-Pkcs磷酸化,進(jìn)一步參與DNA損傷應(yīng)激反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)室前期研究TAB182可以增加幅射的敏感性,并且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等功能,但在肝癌細(xì)胞中還沒有深入的研究。阿司匹林是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于心血管疾病中,阿司匹林在預(yù)防胃癌、食管癌的發(fā)生已經(jīng)被證實(shí),阿司匹林在抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡等方面也有廣泛研究,但阿司匹林對(duì)于TAB182沉默的肝癌細(xì)胞的影響目前還沒有相關(guān)研究。我們通過阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2細(xì)胞可進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡,為放療及藥物治療肝癌提供新的基因靶點(diǎn),改善患者預(yù)后。目的:本實(shí)驗(yàn)以離體的肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象,通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選單克隆技術(shù)建立TAB182沉默的HepG2細(xì)胞模型,研究γ-射線和阿司匹林對(duì)TAB182沉默的HepG2細(xì)胞的影響。方法:通過CCK-8、細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn),研究γ-射線照射后HepG2細(xì)胞增殖率和存活率的變化,并應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)照射后HepG2細(xì)胞周期的變化。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2細(xì)胞后增殖能力的變化,流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)阿司匹林對(duì)TAB182沉默的HepG2細(xì)胞周期及凋亡的改變。應(yīng)用Western blot檢測(cè)照射及阿司匹林作用于TAB182沉默的HepG2細(xì)胞后凋亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1抑制TAB182基因表達(dá)可增加肝癌HepG2輻射敏感性1.1成功建立的TAB182沉默的HepG2細(xì)胞系:與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的HepG2-NC細(xì)胞對(duì)比,TAB182蛋白在HepG2-sh-TAB182細(xì)胞中表達(dá)降低,說明TAB182沉默的細(xì)胞系建立成功。1.2沉默TAB182基因能增加輻射對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用:分別于0、2、4、6、8Gy的γ-射線照射24h后收集HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞,采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,2Gyγ-射線照射下,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞與未照射細(xì)胞相比,增殖率沒有明顯變化(P0.05)。與未照射HepG2-sh-TAB182及HepG2-NC細(xì)胞相比,在4、6、8Gyγ-射線照射后,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞較未照HepG2-sh-TAB182細(xì)胞增殖率明顯降低(P0.05),而HepG2-NC細(xì)胞在8Gyγ-射線照射后才出現(xiàn)增殖率的降低(P0.05);在同一劑量下,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞相比增殖率下降(P0.05),說明沉默TAB182基因能增加輻射對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。1.3沉默TAB182基因能增加輻射對(duì)HepG2細(xì)胞生存率的抑制作用:采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)0、1、2、4、8Gyγ-射線照射下HepG2細(xì)胞生存率的變化。在1Gyγ-射線照射后,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與未照射HepG2-sh-TAB182細(xì)胞相比生存率明顯降低(P0.01),而HepG2-NC細(xì)胞與未照射的HepG2-NC細(xì)胞相比生存率沒有明顯變化(P0.05),在2、4、8Gyγ-射線照射后,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞與各自未照射細(xì)胞比較生存率均出現(xiàn)明顯的降低(P0.01)。在同一劑量下,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞相比生存率降低(P0.05),說明沉默TAB182基因表達(dá)能增加輻射對(duì)HepG2細(xì)胞生存率的抑制作用。1.4沉默TAB182能延長HepG2細(xì)胞幅射后G2/M期的周期阻滯:γ-射線照射后HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞均出現(xiàn)G2/M期阻滯,但在照射后24小時(shí),HepG2-sh-TAB182細(xì)胞在G2/M期的周期阻滯依然存在,而HepG2-NC細(xì)胞的G2/M期的周期阻滯已經(jīng)解除,說明沉默TAB182能延長HepG2細(xì)胞幅射后G2/M期的周期阻滯,抑制細(xì)胞分裂,此可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。2抑制TAB182基因表達(dá)可提高阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞的療效2.1沉默TAB182基因能增加阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用:分別應(yīng)用0、0.5、1、2、4、8、16mmol/l阿司匹林作用24小時(shí)收集HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞,隨著阿司匹林濃度的增加,對(duì)兩種細(xì)胞增殖抑制率也逐漸增高,在相同濃度下,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞比HepG2-NC細(xì)胞增殖抑制率要高(P0.05),說明沉默TAB182基因能增加阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用。2.2沉默TAB182能延長HepG2細(xì)胞幅射后G2/M期的周期阻滯:將8mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HepG2-sh-TAB182細(xì)胞在4h即有明顯得G2/M期周期阻滯(P0.01),而HepG2-NC細(xì)胞在4h時(shí)未發(fā)現(xiàn)G2/M期周期阻滯,在12h及24小時(shí)時(shí)兩者均存在G2/M周期阻滯(敲低組P0.01,對(duì)照組P0.05),在36h,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞仍存在周期阻滯,而HepG2-NC細(xì)胞周期阻滯已經(jīng)解除,說明TAB182基因沉默后可延長阿司匹林作用后HepG2細(xì)胞G2/M期的周期阻滯,抑制細(xì)胞分裂。2.3沉默TAB182能增加阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡:將0、1、8、16mmo/l的阿司匹林作用于HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞,阿司匹林作用HepG2-sh-TAB182細(xì)胞后即出現(xiàn)凋亡,隨著阿司匹林濃度的增加,細(xì)胞的凋亡率也隨著升高,而HepG2-NC細(xì)胞在8、16mmo/l的阿司匹林作用下才有凋亡的增高(P0.05),相同濃度下的HepG2-sh-TAB182細(xì)胞與HepG2-NC細(xì)胞相比較,HepG2-sh-TAB182細(xì)胞的凋亡率明顯高于HepG2-NC細(xì)胞(P0.05),說明沉默TAB182能增加阿司匹林對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡。2.4沉默TAB182能增加輻射及阿司匹林作用后HepG2細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá):將4Gyγ-射線照射、16mmo/L阿司匹林作用HepG2-sh-TAB182細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白均較阿司匹林作用前表達(dá)明顯增加(P0.05),輻射后HepG2-sh-TAB182細(xì)胞比HepG2-NC細(xì)胞cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9蛋白的表達(dá)也明顯增加(P0.05),說明沉默TAB182可促進(jìn)輻射后的細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1驗(yàn)證成功建立的TAB182沉默的細(xì)胞系2沉默TAB182后,在照射及阿司匹林的處理下,能夠抑制細(xì)胞的增殖率、生存率及細(xì)胞分裂,造成細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAB182可能是肝癌治療的敏感基因,可能為肝癌的治療提供新的治療靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄒聯(lián)洪;徐勤枝;劉曉丹;王豫;李兵;鐘才高;周平坤;;TAB182對(duì)電離輻射誘發(fā)細(xì)胞周期G_2/M阻滯的調(diào)節(jié)作用[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2012年09期

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1 鄒聯(lián)洪;TAB182在電離輻射誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用[D];中南大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2409364