【摘要】：目的:探討唑來膦酸對HCT116細胞的生物學作用及其分子機制。方法:1)采用CCK-8方法檢測不同濃度唑來膦酸對HCT116細胞增殖的作用,不同濃度唑來膦酸孵育HCT116細胞72h后,測定細胞存活率,并計算IC50值;2)采用克隆形成實驗觀察唑來膦酸對HCT116細胞克隆形成能力的影響;3)采用流式細胞分析術分析25μmol/L和50μmol/L的唑來膦酸作用HCT116細胞48h后細胞的凋亡比例;4)25μmol/L和50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細胞24h、48h和72h后,用線粒體膜電位特異性染料JC-1避光孵育細胞15min,采用熒光顯微鏡和流式細胞術分析其紅色熒光強度的變化;5)Western blot方法分析唑來膦酸作用HCT116細胞72h后,細胞線粒體內和胞漿內cytochrome C含量的改變以及胞漿內caspase-3的活化情況;6)建立HCT116細胞裸鼠移植瘤模型,并觀測給藥唑來膦酸后腫瘤生長、瘤塊重量及腫瘤組織形態(tài)學的變化。結果:1)唑來膦酸可抑制HCT116細胞的增殖,并具有劑量依賴性,IC50=26.79μmol/L;2)IC50濃度的唑來膦酸可顯著抑制HCT116細胞克隆的形成;3)唑來膦酸25μmol/L和50μmol/L作用HCT116細胞48h后,HCT116細胞發(fā)生凋亡,凋亡比例分別為11.6%±0.5%、49.2%±3.4%,p0.05;4)25μmol/L和50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細胞24h、48h和72h后,熒光顯微鏡觀察結果顯示JC-1被激發(fā)出的紅色熒光強度顯著降低,流式細胞術分析結果顯示被激發(fā)出JC-1紅色熒光的細胞比例顯著減少:25μmol/L唑來膦酸作用HCT116細胞24h、48h和72h后,JC-1紅色熒光細胞的比例分別為96.49%±2.1%、86.13%±3.2%、74.23%±5.3%,p0.05;50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細胞24h、48h和72h后,JC-1紅色熒光細胞的比例分別為55.21%±5.9%、66.65%±2.3%、38.71%±4.3%,p0.05;5)Western blot結果顯示25μmol/L和50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細胞72h后,線粒體中cytochrome C減少,胞漿中cytochrome C增多,同時,活化的caspase 3增多。說明cytochrome C從線粒體內釋放至胞漿,并最終激活了Caspase-3;6)體內實驗結果顯示2mg/kg唑來膦酸治療可顯著抑制小鼠腫瘤生長,末次測量腫瘤體積對照組為2289.4±363.8mm3,唑來膦酸組為926.42±238.3mm3;試驗結束后剝離腫瘤組織,對照組、2mg/kg唑來膦酸治療組的平均瘤重分別為2.53±0.33g、1.65±0.31g,唑來膦酸組腫瘤體積顯著小于對照組,抑瘤率為:34.8%;移植瘤的組織形態(tài)學檢查顯示唑來膦酸誘導了腫瘤細胞凋亡。結論:唑來膦酸能抑制HCT116細胞增殖和克隆形成,其機制是通過使線粒體跨膜電位下降,通透性增強,導致cytochrome C由線粒體釋放至細胞漿,最終激活了caspase-3,導致細胞凋亡。動物實驗證明唑來膦酸可抑制體內腫瘤生長,誘導腫瘤組織發(fā)生凋亡。該研究為ZOL作為結直腸癌治療藥物的開發(fā)與臨床應用提供了理論依據。
[Abstract]:Aim: to investigate the biological effect of zoledronic acid on HCT116 cells and its molecular mechanism. Methods: 1) the effects of zoledronic acid at different concentrations on the proliferation of HCT116 cells were detected by CCK-8 method. After incubated with zoledronic acid for 72 hours, the survival rate of HCT116 cells was measured and the IC50 value was calculated. 2) the effect of zoledronic acid on the clonal formation of HCT116 cells was observed by clone formation assay, 3) the apoptotic ratio of HCT116 cells treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 48 h was analyzed by flow cytometry. 4) after treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 24 h and 72 h, the cells were incubated with mitochondrial membrane potential specific dye JC-1 for 15 min. The changes of red fluorescence intensity were analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry. 5) Western blot method was used to analyze the changes of cytochrome C content in mitochondria and cytoplasm and the activation of caspase-3 in cytoplasm of HCT116 cells treated with zoledronic acid for 72 hours. 6) the model of transplanted tumor of HCT116 cells in nude mice was established, and the tumor growth, tumor mass weight and tumor histomorphology were observed after administration of azoledronic acid. Results: 1) Zoledronic acid inhibited the proliferation of HCT116 cells in a dose-dependent manner, and zoledronic acid at the concentration of IC50=26.79 渭 mol/L;2 significantly inhibited the clone formation of HCT116 cells. 3) after treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L of zoledronic acid for 48 h, the apoptosis of HCT116 cells was 11.6% 鹵0.5% and 49.2% 鹵3.4%, respectively. 4) after treatment of HCT116 cells with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 48 h and 72 h, the results of fluorescence microscopy showed that the red fluorescence intensity induced by JC-1 was significantly decreased. The results of flow cytometry showed that the percentage of cells stimulated with JC-1 red fluorescence was significantly decreased: the percentage of JC-1 red fluorescent cells was 96.49% 鹵2.1 after treatment with 25 渭 mol/L zoledronic acid for 24 h and 72 h, respectively. 86.13% 鹵3.2% and 74.23% 鹵5.3%. After treatment with 50 渭 mol/L zoledronic acid for 24 h or 72 h, the percentage of JC-1 red fluorescent cells was 55.21% 鹵5.9% 鹵6.65% 鹵2.3% and 38.71% 鹵4.3% respectively. 5) Western blot results showed that after treated with 25 渭 mol/L and 50 渭 mol/L zoledronic acid for 72 h, cytochrome C in mitochondria decreased, cytochrome C in cytoplasm increased and activated caspase 3 increased. The results showed that cytochrome C was released from mitochondria to cytoplasm and Caspase-3; was activated. 6) the results of in vivo experiments showed that 2mg/kg zoledronic acid could significantly inhibit tumor growth in mice. The tumor volume in the last tumor control group was 2289.4 鹵363.8mm ~ (-3) mm ~ (-3), and that in the zoledronic acid group was 926.42 鹵238.3 mm ~ (-3). The mean tumor weight of the control group and 2mg/kg zoledronic acid treatment group was 2.53 鹵0.33 g / L 1.65 鹵0.31 g respectively, and the tumor volume of zoledronic acid group was significantly smaller than that of the control group (34.8%). Histological examination of transplanted tumor showed that zoledronic acid induced apoptosis of tumor cells. Conclusion: zoledronic acid can inhibit the proliferation and clone formation of HCT116 cells through the decrease of mitochondrial transmembrane potential and the enhancement of permeability, resulting in the release of cytochrome C from mitochondria to the cytoplasm and the activation of caspase-3, to induce apoptosis. Animal experiments have shown that zoledronic acid can inhibit tumor growth and induce apoptosis in tumor tissues. This study provides a theoretical basis for the development and clinical application of ZOL as a therapeutic drug for colorectal cancer.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：2379250