【摘要】：研究目的血管生成擬態(tài)(VM)是一種非內(nèi)皮血管依賴的微循環(huán)模式,促進腫瘤的轉(zhuǎn)移以及疾病的進展。本課題組前期實驗研究表明人乳腺癌組織中存在血管生成擬態(tài),并往往造成患者不良的預后,但是其機制仍然不十分明確。另一方面,近些年來研究表明乳腺癌腫瘤干細胞(BCSC)與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及治療抵抗相關(guān),并且在遠端部位賦予腫瘤細胞形成轉(zhuǎn)移灶的能力。Nodal信號在胚胎的發(fā)育階段扮演重要角色,而近期研究發(fā)現(xiàn)其能夠在惡性腫瘤組織中重新表達。鑒于Nodal在胚胎及腫瘤中的作用,本實驗旨在探討Nodal信號是否在乳腺癌中促進血管生成擬態(tài)形成及在乳腺癌干細胞中的作用,并進一步探究其機制及信號通路。希望能為今后的應用找到新的靶點從而抑制乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移進而最終提高患者生存率。研究方法1、利用免疫組織化學染色分析100例乳腺癌樣本中Nodal表達情況,同時利用Western blot實驗檢測并比較人乳腺癌腫瘤組織以及配對的癌旁組織中Nodal蛋白表達水平。并進一步利用臨床病理資料分析乳腺癌病例中Nodal與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學分級、分期及生存率的關(guān)系。2、乳腺癌切片進行CD31\PAS雙重染色判斷VM結(jié)構(gòu),并應用Kaplan-Meier進行生存分析。此外,利用免疫組化染色判定Nodal表達與VE-cadherin、CD44、Slug表達之間的關(guān)系。3、通過Western blot分析了乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231中Nodal蛋白的本底表達情況。利用慢病毒質(zhì)粒從基因水平干擾或過表達Nodal,并篩選建立穩(wěn)定的Nodal敲低或過表達細胞系。Western blot檢測4種Nodal sh RNA慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果。嘌呤霉素篩選后Western blot,RT-PCR驗證結(jié)果。4、為了排除脫靶效應,通過過表達Nodal敲低細胞系(sh Nodal4)中Nodal水平進行挽救實驗,Western blot檢測表達恢復情況,同時選取231-sh Nodal3及231-sh Nodal4,及Nodal表達恢復組進行后續(xù)功能試驗5、Western blot和RT-PCR實驗檢測Nodal與內(nèi)皮特異性標記物VE-cadherin表達的關(guān)系。利用膠上及膠內(nèi)三維培養(yǎng)觀察各組乳腺癌細胞體外形成管道結(jié)構(gòu)的能力,并對三維管道進行免疫熒光Nodal/VE-cadherin雙重染色,并應用激光共聚焦顯微鏡分析。6、利用western blot檢測Nodal敲低或過表達的乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中p-Smad2/3水平。在MCF-7-Con,MCF-Nodal和MDA-MB-231-sh Con細胞應用SB431542,利用Western blot檢測Nodal,p-Smad2/3,VE-cadherin,MMP2及MMP9蛋白的表達水平,并通過免疫熒光驗證。明膠酶譜檢測MMP2及MMP9蛋白活性。最后三維培養(yǎng)中應用SB431542,觀察Smad2/3通路在VM形成中的作用。7、利用劃痕實驗、遷移實驗和侵襲實驗分析Nodal信號及Smad2/3通路對乳腺癌遷移及侵襲能力的影響。通過Western blot檢測EMT相關(guān)標記物Vimentin、N-cadherin及E-cadherin表達水平,以及Nodal對轉(zhuǎn)錄因子Slug,Snail和c-Myc表達的影響,進一步利用各組乳腺癌細胞爬片的免疫熒光染色驗證并明確各指標在細胞的定位關(guān)系及表達。8、利用腫瘤細胞平板克隆形實驗來評估乳腺癌細胞自我更新以及增殖能力,通過利用無血清懸浮培養(yǎng)測定乳腺癌細胞形成腫瘤干細胞球能力。同時應用SB431542觀察對各組細胞的影響。9、通過Western blot探究Nodal及Smad2/3通路對乳腺癌相關(guān)的干細胞標記物ALDH1,CD44及CD133的表達水平,以及對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox2,Oct4和Nanog表達的影響。并進一步利用各組乳腺癌細胞爬片進行免疫熒光染色驗證。10、利用各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系皮下注射裸鼠,驗證Nodal信號在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中促進腫瘤形成及增殖中的作用,通過測量記錄皮下腫瘤的直徑,繪制裸鼠移植瘤生長曲線,并腹腔隔天注射SB431542溶液(10mg/kg/小鼠),驗證SB431542應用在體內(nèi)的可行性。11、對各組移植瘤切片進行Endomucin/PAS免疫組織化學雙重染色,顯微鏡下計數(shù)VM形成的數(shù)量。此外進行Nodal、p-Smad2/3、VE-cadherin、E-cadherin、Vimentin、MMP2、Slug及CD44免疫組織化學染色,檢測移植瘤中VM及CSC相關(guān)蛋白的表達。研究結(jié)果1、與配對的鄰近正常組織相比,乳腺癌組織中的Nodal蛋白水平顯著上調(diào)(P0.05)。免疫組化結(jié)果中,Nodal陽性染色定位于乳腺癌細胞的胞質(zhì)中,在這100例乳腺癌免疫組化染色中,有62例為Nodal染色陽性,Nodal高表達與發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000),分化較差(P=0.003),生存率低呈正相關(guān)(P=0.013)。2、結(jié)果表明Nodal的表達與乳腺癌中VM的存在呈正相關(guān)(P=0.005)。且與內(nèi)皮特異性標記蛋白VE-cadherin的表達(P=0.000)及Slug染色陽性(P=0.001)高度相關(guān)。同時BCSC標記蛋白CD44的表達導致患者生存率降低(P=0.022),與Nodal表達亦存在顯著相關(guān)性(P=0.000)。3、MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染的4種sh RNA慢病毒質(zhì)粒中,sh Nodal4具有最好的干擾效果,其敲低Nodal表達效率超過80%。而MCF-7細胞轉(zhuǎn)染慢病毒Nodal過表達質(zhì)粒。Western blot及PCR結(jié)果驗證MDA-MB-231中Nodal蛋白表達及m RNA轉(zhuǎn)錄被顯著抑制。MCF-7 Nodal穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中Nodal蛋白表達及m RNA轉(zhuǎn)錄明顯增強。光鏡下觀察,MCF-7-Nodal細胞從上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞樣形態(tài),MDA-MB-231-sh Nodal細胞中EMT表型無非常顯著的逆轉(zhuǎn)。4、Western blot結(jié)果顯示sh Nodal4干擾效率約為80%,sh Nodal3為70%,此外,231-sh Nodal4挽救試驗組中的Nodal表達水平已恢復。5、結(jié)果顯示MDA-MB-231細胞中Nodal表達的下調(diào),降低了VE-cadherin轉(zhuǎn)錄及翻譯水平,并抑制其形成完整的VM樣管道結(jié)構(gòu),作為對比231-sh Control細胞在膠上及膠內(nèi)三維培養(yǎng)中均形成典型的管道樣結(jié)構(gòu);MCF-7實驗組中,Nodal過表達上調(diào)VE-cadherin蛋白和m RNA表達水平,并促使本身無形成VM管道能力的MCF-7細胞在膠上及膠內(nèi)均形成了經(jīng)典的VM樣管道結(jié)構(gòu)。三維管道免疫熒光染色顯示Nodal集中在形成VM樣管道的細胞中以及這些結(jié)構(gòu)的邊緣,同時這些結(jié)構(gòu)管壁高表達VE-cadherin蛋白。6、MDA-MB-231細胞中Nodal的敲低降低Smad2/3磷酸化水平,而MCF-7細胞中Nodal過表達顯著增加Smad2/3的磷酸化。SB431542處理后,Western blot結(jié)果顯示處理組Smad2/3磷酸化水平被顯著抑制,VE-cadherin表達下調(diào)。Western blot及明膠酶譜實驗表明,Nodal能促進MMP2和MMP9的胞內(nèi)的表達和分泌形式蛋白活性的增加。同時,SB431542在一定程度上抑制MMP2和MMP9的表達和活性,且影響體外三維培養(yǎng)中VM的形成。7、Nodal信號能夠促進乳腺癌細胞體外遷移能力以及侵襲能力,而在各實驗組中加入SB431542能夠限制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。Western及免疫熒光結(jié)果表明,Nodal信號可以通過Smad2/3通路上調(diào)間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin,下調(diào)上皮標志物E-cadherin,同時促進轉(zhuǎn)錄因子Snail,Slug和c-Myc的表達。8、在MDA-MB-231細胞中Nodal表達的敲低減少了乳腺癌腫瘤細胞克隆的形成,實驗還觀察到腫瘤干細胞球的形成率及體積顯著降低,而Nodal過表達顯著增加了MCF-7腫瘤細胞克隆的大小和數(shù)量,并增加腫瘤干細胞球的形成能力。應用SB431542后抑制了克隆形成及干細胞球的形成。9、結(jié)果顯示,Nodal信號促進了CSC相關(guān)標記物和因子ALDH1,CD44,CD133,Sox2,Oct4和Nanog的表達水平,當阻斷Smad2/3通路時CSC相關(guān)標記物的表達被不同程度抑制。10、與231-sh Con組相比,在231-sh Nodal組中腫瘤生長顯著減慢(P0.01),該組腫瘤的體積也顯著減少。Nodal的過表達顯著促進MCF7-Nodal組中的腫瘤生長(P0.01)。而SB431542注射組中,腫瘤生長速率被抑制,致瘤性被削弱。11、在乳腺癌裸鼠移植瘤中Nodal信號促進乳腺癌細胞表達VE-cadherin、Vimentin、MMP2、Slug及CD44并降低E-cadherin表達水平。同時能夠在體內(nèi)環(huán)境下促進乳腺癌血管生成擬態(tài)的形成。并證實了SB431542在裸鼠模型應用的可行性,有效減少了VM的形成。結(jié)論1、人乳腺癌組織中Nodal信號的高表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移及不良預相關(guān)2、體外實驗中,Nodal信號上調(diào)VM相關(guān)蛋白的表達水平,并促進乳腺癌細胞在膠上及膠內(nèi)VM的形成,此外Nodal及VE-cadherin在VM管道中的表達具有相關(guān)性。3、Nodal促進Slug、Snail及C-myc表達,增加乳腺癌細胞的遷移、侵襲及塑形能力,并誘導EMT過程從而導致VM的形成。4、另一方面Nodal調(diào)控乳腺癌干細胞表型,促進ALDH1、CD44以及CD133表達,從而增加乳腺癌細胞致瘤性及多分化潛能。5、在乳腺癌細胞中,Smad2/3通路在Nodal信號傳導調(diào)控VM及干細胞表型中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用6、Nodal信號在體內(nèi)實驗中顯著促進乳腺癌細胞致瘤性,并促進VM形成。同時,在體內(nèi)及體外實驗中,SB431542能夠抑制Smad2/3磷酸化從而阻斷Nodal信號轉(zhuǎn)導為乳腺癌治療提供前期實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：2375388