【摘要】：背景與目的:乳腺癌是女性的第一位好發(fā)腫瘤。早期診療效果較好,但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移則嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間與生活質(zhì)量。骨骼,特別是胸骨、脊柱是乳腺癌首要的轉(zhuǎn)移部位,一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移則無有效治愈方法。目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療方案一般采用姑息治療或手術(shù)治療,以改善癥狀為主,尚無治愈方法。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移后會(huì)導(dǎo)致一系列骨相關(guān)事件,包括病理性骨折、神經(jīng)脊髓壓迫、高鈣血癥、骨痛等,嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間與生存質(zhì)量。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移后一般表現(xiàn)為溶骨性病變,但是乳腺癌細(xì)胞并不能直接引起溶骨。骨重塑依賴于成骨細(xì)胞所介導(dǎo)的成骨作用與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的溶骨作用相互協(xié)調(diào),乳腺癌骨轉(zhuǎn)移破壞了正常的骨重塑平衡,進(jìn)而引起溶骨性病變。在這過程中腫瘤細(xì)胞分泌多種因子調(diào)控成骨與破骨細(xì)胞的生理活動(dòng),目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤可分泌RANKL、PThrP、TGF-?、IL等多種因子促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟及其介導(dǎo)的骨吸收,但腫瘤細(xì)胞對成骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用尚不清楚。Semaphorin 4D(Sema 4D)是一類軸突引導(dǎo)生長因子,近年來發(fā)現(xiàn)其在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá),與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。2011年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)小鼠破骨細(xì)胞可分泌Sema 4D調(diào)控成骨細(xì)胞的分化與遷移,在Sema 4D-/-小鼠成骨細(xì)胞分化與遷移能力增強(qiáng),表明Sema 4D除了參與軸突引導(dǎo)、腫瘤進(jìn)展等,還參與骨代謝調(diào)控。因此我們假設(shè),乳腺癌來源的Sema 4D在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移所引起的成骨抑制及腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本課題通過shRNA干擾表達(dá)、Transwell共培養(yǎng)模擬乳腺癌骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境等方法,研究Sema 4D在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中對乳腺癌細(xì)胞自身及成骨細(xì)胞分化的作用與可能機(jī)制,為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移防治提供新的理論基礎(chǔ)。方法:1.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光等方法檢測Sema4D在乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞系的表達(dá),篩選Sema 4D高表達(dá)細(xì)胞細(xì)胞系。2.sh RNA慢病毒轉(zhuǎn)染Sema 4D高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系,嘌呤霉素篩選、擴(kuò)增,實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光等方法確定干擾效率,建立穩(wěn)定的Sema 4D低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系。3.通過CCK-8、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、FCM流式周期檢測干擾Sema 4D表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系增殖、遷移及周期的影響。4.通過Transwell共培養(yǎng)模擬乳腺癌骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色觀察Sema 4D干擾前后乳腺癌細(xì)胞調(diào)控成骨前體細(xì)胞分化能力的變化,以明確Sema 4D在乳腺癌溶骨性骨損害中的作用。5.通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測Transwell共培養(yǎng)下Sema 4D干擾前后乳腺癌細(xì)胞調(diào)控成骨前體細(xì)胞AKT、p-AKT表達(dá)的變化,確定Sema 4D作用的可能機(jī)制。結(jié)果:1.Sema 4D在高侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中m RNA及蛋白表達(dá)表達(dá)均明顯高于低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7;2.Sema 4D sh RNA轉(zhuǎn)染后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Sema 4D m RNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低,成功建立Sema 4D干擾表達(dá)乳腺癌細(xì)胞模型;3.干擾Sema 4D表達(dá)可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移及細(xì)胞周期;4.乳腺癌細(xì)胞與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,乳腺癌細(xì)胞可明顯抑制成骨前體細(xì)胞的分化,干擾Sema 4D表達(dá)后,乳腺癌細(xì)胞系對成骨分化的抑制效應(yīng)明顯減弱;5.乳腺癌細(xì)胞明顯抑制成骨前體細(xì)胞AKT的磷酸化水平,沉默Sema 4D表達(dá)后,成骨前體細(xì)胞AKT磷酸化表達(dá)水平明顯增高。結(jié)論:1.Sema 4D在高侵襲性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中高表達(dá);2.Sema 4D sh RNA可有效干擾乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Sema 4D表達(dá);3.Sema 4D可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期,在促進(jìn)乳腺癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用;4.干擾Sema 4D表達(dá)后,乳腺癌細(xì)胞對成骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)減弱,Sema 4D在乳腺癌抑制成骨分化效應(yīng)中發(fā)揮部分作用;5.乳腺癌來源的Sema 4D可能通過下調(diào)AKT磷酸化,進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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6 劉兆U，

本文編號：2362268