【摘要】：由于飲食習(xí)慣、生活環(huán)境以及遺傳等因素,我國成為食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家。雖然手術(shù)、放療和化療廣泛應(yīng)用于食管癌的治療,但食管癌治療后的五年總生存率依然小于20%。因此,我們需要研究新的策略來治療食管癌。研究發(fā)現(xiàn)當腫瘤直徑生長到1-2 mm的時候,腫瘤的生長必須通過刺激新生血管的生成,來滿足其對氧氣和營養(yǎng)成分的需求。因此,通過抑制腫瘤新生血管的生成來抑制腫瘤的生長,成為當前另外一種腫瘤免疫治療的新策略。目前已知的和腫瘤血管生成相關(guān)的因子有30多種,通過抑制相關(guān)的通路和因子來阻斷腫瘤血管生成,也取得了一定的效果。2003年貝伐單抗(Bevacizumab)成為第一個被FDA批準的用于腫瘤血管生成抑制劑,隨后抗血管生成單克隆抗體逐漸應(yīng)用于臨床。但是腫瘤血管生成的方式多樣,信號通路復(fù)雜,使目前針對單一靶點的藥物治療效果非常有限。腫瘤免疫治療是通過激發(fā)和增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答,調(diào)動宿主的天然防御機制,從而達到控制和殺滅腫瘤細胞的一種新的治療方法,逐漸成為繼手術(shù)、放化療之后又一種腫瘤治療的重要手段。腫瘤組織新生血管的內(nèi)皮細胞處于十分活躍的增殖狀態(tài),而正常組織血管內(nèi)皮細胞一般處于靜止狀態(tài)。以腫瘤血管內(nèi)皮細胞為靶點的主動免疫治療,靶向腫瘤血管內(nèi)皮細胞增殖的多個抗原,產(chǎn)生綜合抑制腫瘤血管生成的效果。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)是增殖旺盛的內(nèi)皮細胞,高表達內(nèi)皮細胞增殖的相關(guān)抗原,與體內(nèi)增殖活躍的腫瘤血管內(nèi)皮細胞表達一些相同的血管內(nèi)皮細胞增殖相關(guān)抗原。以HUVEC細胞制備疫苗,靶向多個腫瘤血管增殖的相關(guān)抗原,產(chǎn)生綜合抑制腫瘤血管生成的效果。本研究構(gòu)建了人源化的NOD/SCID小鼠食管癌移植瘤模型,探討HUVEC疫苗對人食管癌的抗腫瘤血管生成作用,為抗腫瘤血管生成免疫治療提供依據(jù)。方法:1.通過對24只NOD/SCID小鼠眼眶后叢靜脈取血,獲得血清。利用ELISA法檢測NOD/SCID小鼠外周血血清中Ig G蛋白含量,檢測小鼠是否發(fā)生“免疫滲漏”現(xiàn)象,并利用標準曲線計算所有小鼠血清中的Ig G蛋白含量。2.利用密度梯度離心法分離出人外周血的單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后對NOD/SCID小鼠腹腔注射PBMC(4×106個/只)進行免疫重建。4周之后,獲得小鼠外周血,通過流式細胞儀檢測小鼠外周血中人的CD45+T淋巴細胞表達情況。3.將免疫重建成功的小鼠隨機分為2組,一組為PBMC+HUVEC組(n=8),在小鼠左側(cè)腋窩淋巴結(jié)周圍注射HUVEC疫苗進行免疫(5×106個/只),1次/周,一共5次,刺激機體免疫能力的增強;另外一組為PBMC組(n=8)小鼠注射PBS。未免疫重建的小鼠(n=8)作為空白對照組注射PBS。一共3組進行本次實驗。4.對PBS組小鼠(n=8)、PBMC組(n=8)和PBMC+HUVEC組(n=8)小鼠分別在背部皮下接種人食管鱗癌細胞EC9706(6×106個/只),待成瘤之后隔天測量,觀察腫瘤的大小,成瘤后測量至第28天處死,得到腫瘤組織,稱重并拍照。分別取3組小鼠的血清用ELISA法進行抗HUVEC抗體效價檢測,測量450 nm的OD值檢測小鼠血清中抗腫瘤血管內(nèi)皮細胞抗體生成情況。隨后,通過血紅蛋白測定實驗,將小鼠腫瘤組織研磨,并利用試劑盒在540 nm檢測腫瘤組織研磨物上清中血紅蛋白的濃度;將小鼠腫瘤組織用中性甲醛固定,石蠟包塊,然后利用免疫組織化學(xué)技術(shù),孵育抗體CD31,然后用DAB顯色液染色,檢查腫瘤組織中CD31的表達,以檢測腫瘤組織新生血管的生成情況。5.剝離小鼠脾臟組織,稱重并拍照;將小鼠脾臟組織研磨,過濾并用紅細胞裂解液裂解紅細胞,淋巴細胞分離液分離得到淋巴細胞。通過流式細胞儀檢測3組小鼠等質(zhì)量脾臟組織中CD45+T淋巴細胞的表達情況。提取腫瘤組織的RNA,并用Q-PCR的方法測定腫瘤組織中VEGFR2和CD144基因的表達情況;提取腫瘤組織的蛋白,用Western blot檢測腫瘤組織VEGFR2和CD144抗原的表達。運用Western blot檢測3組小鼠血清中抗VEGFR2和CD144抗體的表達情況,以及ELISA法檢測3組小鼠血清抗HUVEC抗體的能力,來探索HUVEC疫苗抑制腫瘤血管生成的原因。結(jié)果:1.通過ELISA試劑盒對小鼠外周血中的小鼠Ig G含量的檢測,結(jié)合Curve Expert軟件得到的標準曲線,計算得到小鼠外周血中的Ig G含量都小于2 ng/ml,遠遠小于1μg/ml的標準;所有小鼠在后天環(huán)境的飼養(yǎng)中未發(fā)生“免疫滲漏”。2.流式細胞術(shù)分析免疫重建4周小鼠外周血中CD45+T淋巴細胞的表達量,結(jié)果顯示CD45+T淋巴細胞0.1%,證明免疫重建成功。3.剝離小鼠腫瘤后稱量,3組小鼠腫瘤組織的重量分別是PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.01);三組小鼠血清抗HUVEC抗體效價:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.05);腫瘤組織血紅蛋白含量:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.05);免疫組化檢測腫瘤組織切片腫瘤微血管密度:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.05)。4.剝離小鼠脾臟后稱量,3組小鼠脾臟組織的重量分別是PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.05);流式細胞術(shù)檢測16周3組小鼠脾臟分離得到的淋巴細胞和外周血中CD45+T淋巴細胞表達量:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.001)。5.Q-PCR檢測腫瘤組織中CD144和VEGFR2基因的表達情況:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.05);腫瘤組織提取蛋白檢測VEGFR2和CD144的抗原表達情況:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.05),血清中VEGFR2和CD144抗體的表達情況:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.001);ELISA檢測三組小鼠血清中的抗HUVEC抗體的抗性:PBS組PBMC組PBMC+HUVEC組(p0.001)。結(jié)論:1.注射人PBMC后,NOD/SCID小鼠免疫重建成功;2.HUVEC疫苗通過抑制腫瘤新生血管的生成,達到抑制人食管癌移植瘤生長的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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