【摘要】：低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP-5)是低密度脂蛋白受體家族成員之一,該蛋白質(zhì)屬于單跨膜受體,由1615個氨基酸殘基組成,分為胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)三個區(qū)。LRP-5與其家族中另一個成員LRP-6高度同源。研究表明,LRP-5/LRP-6與七跨膜受體蛋白質(zhì)FZD共同構(gòu)成了WNT/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的受體系統(tǒng)。LRP-5/LRP-6是配體WNTs蛋白質(zhì)結(jié)合的輔受體,當配體WNTs與FZD和LRP-5/LRP-6同時結(jié)合時,該信號通路才能被激活。而WNT/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常調(diào)控與癌癥的關(guān)系是目前研究的一個熱點問題。本研究以WNT/β-catenin信號通路中輔受體LRP-5為切入點,應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默LRP-5基因表達,探討WNT/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變對胃癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為及差異蛋白質(zhì)組學(xué)的影響,以期探討胃癌發(fā)病機制,為胃癌治療的可能藥物靶點提供實驗依據(jù)。首先,用qRT-PCR和免疫組化的方法檢測了不同分化程度的胃癌組織中LRP-5基因的表達狀態(tài),為下一步開展RNAi實驗奠定可行性基礎(chǔ)研究。結(jié)果顯示,中分化、低分化的胃癌組織中LRP-5高表達,與正常胃組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05),而且伴有淋巴細胞轉(zhuǎn)移的胃癌組織中也呈現(xiàn)LRP-5高表達。這提示LRP-5與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和惡性程度相關(guān)。其次,構(gòu)建了4個針對LRP-5基因不同位點的pGPU6/GFP/Neo-LRP-5干擾質(zhì)粒,進行轉(zhuǎn)染效率和干擾效率的評價后,成功篩選出了pGPU6/GFP/Neo-LRP-5-Homo-4868(L68)干擾質(zhì)粒。經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染48h沉默MGC-803中LRP-5基因表達后,觀察其對細胞增殖、粘附、凋亡、周期、侵襲、遷移的影響。結(jié)果顯示:1、CCK8法檢測,LRP-5基因干擾組轉(zhuǎn)染MGC-803細胞48h,相對生長速度顯著低于空白對照組和陰性對照組(P0.05);2、LRP-5基因干擾組MGC-803細胞的粘附細胞數(shù)為155.00±18.33,較空白對照組和陰性對照組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3、流式細胞儀雙染法檢測細胞凋亡,在LRP-5干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MGC-803細胞48h后,活細胞數(shù)量減少、凋亡細胞增多,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05);4、流式細胞儀PI單染檢測細胞周期,在LRP-5干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MGC-803細胞48h后,LRP-5干擾組的S期比例升高、G2期比例降低,發(fā)生了S期阻滯現(xiàn)象;5、Transwell小室基底膜實驗表明,LRP-5干擾組侵襲遷移到Transwell基底膜下層的細胞計數(shù)為(38.67±3.51),與空白對照組(52.67±4.51)、Mock組(50.67±3.79)、陰性對照組(47.00±4.36)比較,細胞的侵襲能力有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05);6、劃痕實驗顯示,LRP-5干擾組MGC-803細胞的遷移愈合率為0.7509±0.0108,與空白對照組和陰性對照組比較,愈合率下降,遷移能力下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。最后,本研究采用RNAi技術(shù)沉默人胃癌MGC-803細胞中LRP-5基因表達,在轉(zhuǎn)染MGC-803細胞48h后,抽提干擾組和陰性對照組細胞總蛋白。應(yīng)用2D電泳分離純化蛋白質(zhì)、PDQuest軟件分析2D電泳膠圖,結(jié)果顯示,兩組之間共有29個差異蛋白質(zhì)點。選擇其中15個點進行質(zhì)譜鑒定,成功12個。與陰性對照組比較,L68干擾組中有10個點上調(diào),2個點下調(diào)。這些蛋白質(zhì)包括:細胞骨架、分子伴侶、細胞周期、細胞增殖、糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)。本研究首次應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默LRP-5基因,對胃癌MGC-803細胞的生物學(xué)行為及差異蛋白質(zhì)的影響進行深入研究,初步發(fā)現(xiàn)了LRP-5的低表達可抑制胃癌MGC-803細胞的增殖、遷移和侵襲,為探討胃癌發(fā)病機制和開發(fā)胃癌治療的可能藥物靶點提供了實驗依據(jù)。
[Abstract]:The low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP-5) is one of the members of the low-density lipoprotein receptor family, which belongs to a single-transmembrane receptor and consists of 1615 amino acid residues, and is divided into three regions of an intracellular region, a transmembrane region and an extracellular region. The LRP-5 is highly homologous to the other member LRP-6 in the family. The study shows that the LRP-5/ LRP-6 and the seven-transmembrane receptor protein FZD form the receptor system of the WNT/ HCO3-catenin signal transduction pathway. LRP-5/ LRP-6 is an auxiliary receptor for ligand WNTs protein binding, which can be activated when ligand WNTs is combined with FZD and LRP-5/ LRP-6. The relationship between the abnormal regulation and the cancer of the WNT/ P-catenin signal transduction pathway is a hot issue in the current research. In this study, the LRP-5 gene expression in WNT/ HCO3-cattenin signal pathway was used to silence the expression of LRP-5 gene, and the effects of the change of WNT/ P-catenin signal transduction pathway on the proliferation, apoptosis, invasion and migration of gastric cancer cells and the differential proteomics were discussed. Objective To study the mechanism of gastric cancer and provide experimental basis for possible drug target for gastric cancer treatment. First, the expression status of LRP-5 gene in gastric cancer tissues with different degree of differentiation was detected by qRT-PCR and immunohistochemistry, and the feasibility of the next step was studied. The results showed that the high expression of LRP-5 in the middle and low-differentiated gastric cancer tissues was significantly different from that of the normal gastric tissues (P <0.05), and the LRP-5 high expression was also present in the gastric cancer tissues with the lymphocyte metastasis. This suggests that LRP-5 is associated with the occurrence, development, metastasis and malignancy of gastric cancer. The pGPU6/ GFP/ Neo-LRP-5 interference plasmid was constructed and the pGU6/ GFP/ Neo-LRP-5-Homo-4868 (L68) interference plasmid was successfully screened. After transient transfection of the LRP-5 gene in MGC-803, the effects of the expression of LRP-5 on cell proliferation, adhesion, apoptosis, cycle, invasion and migration were observed. The results showed that: 1, CCK8 method, LRP-5 gene interference group was transfected into MGC-803 cells for 48h, and the relative growth rate was significantly lower than that of blank control group and negative control group (P0.05). The number of adherent cells of MGC-803 cells in LRP-5 gene interference group was 155. 00-18.33, and the control group and negative control group increased. The difference was significant (P0.05); 3, the cell apoptosis was detected by flow cytometry double-staining method, and after the LRP-5 interference plasmid was transfected into the MGC-803 cells for 48h, the number of living cells was reduced, the number of apoptotic cells increased, and the difference with the negative control group was statistically significant (P 0.05); and 4, The cell cycle of the cell cycle was detected by flow cytometry PI. The S-phase ratio of LRP-5 interference group was increased and the proportion of G2 phase was decreased after 48 h of the LRP-5 interference plasmid. The cell count of LRP-5 interference group invasion and migration to the lower layer of Transwell basement membrane was (38. 67-3.51), compared with the blank control group (52. 67-4.51), the Mock group (50. 67-3.79) and the negative control group (47. 00-4.36), the invasion ability of the cells decreased and the difference was statistically significant (P-0.05); The results showed that the rate of migration and healing of MGC-803 cells in LRP-5 interference group was 0. 7509-0. 0108, compared with the blank control group and the negative control group, the healing rate decreased, the migration ability decreased, and the difference was statistically significant (P0.05). Finally, the LRP-5 gene expression in the MGC-803 cell of human gastric cancer was silenced by RNAi, and the total protein of the interfering group and the negative control group was extracted after the MGC-803 cell was transfected for 48h. The protein and PDQuest software were separated and purified by 2D electrophoresis. The results showed that there were 29 different protein points between the two groups. 15 of them were selected for mass spectrometry and 12 were successful. Compared with the negative control group, 10 of the L68 interference groups were up-regulated and 2 points were down-regulated. These proteins include a cytoskeleton, a molecular chaperone, a cell cycle, cell proliferation, and sugar metabolism-related proteins. In this study, the LRP-5 gene was used to silence the effects of LRP-5 gene on the biological behavior and differential protein of MGC-803 cells in gastric cancer. The low expression of LRP-5 was found to inhibit the proliferation, migration and invasion of MGC-803 cells in gastric cancer. In order to study the mechanism of gastric cancer and the possible drug target for the development of gastric cancer, the experimental basis is provided.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于成功,李敏,莫劍忠,蕭樹東;胃癌細胞垂體腺苷環(huán)化酶激活肽相關(guān)受體分析[J];胃腸病學(xué);2000年02期

2 薛英威,耿敬姝,劉曉民,劉立人,高小敏,陳國林,張豈凡,趙家宏;胃癌細胞的流式分析及臨床意義[J];腫瘤防治研究;2000年03期

3 陳堅,林庚金,錢立平,程建,施冬云,張亞東,劉珊林;內(nèi)源性活性氧水平及錳型超氧化物歧化酶的表達與胃癌細胞分化、增殖相關(guān)[J];生物物理學(xué)報;2003年02期

4 李瑩,藥立波,韓炯,王立峰,韓月恒,劉新平,林樹新,俞強;胃癌細胞抗脫落凋亡的分子機制[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2004年02期

5 羅和生,王維,包鵬輝,張翼;核因子-κB活性增強參與胃癌細胞長春新堿耐藥[J];中華消化雜志;2004年08期

6 劉冀紅,曹偉新,紀玉寶,張軼,劉炳亞,朱正綱,燕敏,林言箴;右旋甲硫氨酸對胃癌細胞作用初探[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2005年01期

7 齊元玲;于皆平;劉啟勝;鄧全軍;曹俊;于紅剛;;抑癌基因PTEN在胃癌細胞中的表達及意義[J];廣東醫(yī)學(xué);2006年03期

8 何必立;呂賓;徐毅;苗青;范一宏;;溫郁金對胃癌細胞的抑制作用及其對血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J];中醫(yī)藥學(xué)刊;2006年09期

9 郭強;李榮;李慶芳;夏紹友;杜曉輝;王立生;;高表達鞘氨醇激酶對胃癌細胞生物學(xué)特性的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年12期

10 陳先來;肖曉旦;楊榮;劉建平;;基于誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的胃癌細胞識別研究[J];中國循證醫(yī)學(xué)雜志;2007年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 韓霜;雷婷;韓者藝;劉杰;郭雪艷;丁睿;吳開春;丁杰;樊代明;;分化抑制因子1對胃癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

2 陳韶華;吳靈嬌;吳鴻儒;吳雅春;厲有名;;低濃度酒精對胃癌細胞活性及周期抑制[A];中華醫(yī)學(xué)會第12次全國內(nèi)科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

3 陳韶華;吳靈嬌;吳鴻儒;吳雅春;厲有名;;低濃度酒精對胃癌細胞活性及周期抑制[A];第二屆浙江省消化病學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2009年

4 李娜;郭瑞芳;李文梅;邵建敏;汪浩;趙康;李書婷;王敬強;王融;徐寧志;劉斯奇;呂有勇;;大蒜素處理在胃癌細胞中引發(fā)的蛋白質(zhì)表達響應(yīng)[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第二屆學(xué)術(shù)大會論文摘要論文集[C];2004年

5 ;多西紫杉醇對胃癌細胞作用及其機制的研究[A];第四屆中國腫瘤大會中國藥理學(xué)會腫瘤藥理專業(yè)委員會分會場學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

6 樓儷泓;;15-羥基前列腺素脫氫酶對胃癌細胞周期影響的試驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

7 朗瑋;;中藥方劑1號對胃癌細胞體外生長及細胞粘附分子的影響[A];浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會消化專業(yè)第八次學(xué)術(shù)年會暨省中西醫(yī)結(jié)合消化系疾病新進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

8 鞏龍靜;馬君;周涵婧;鄭榮兒;;胃癌細胞的表面增強拉曼光譜研究[A];中國光學(xué)學(xué)會2011年學(xué)術(shù)大會摘要集[C];2011年

9 謝少茹;沈洪;趙崧;張國新;郝波;劉增巍;施瑞華;;黃芪多糖對胃癌細胞的抑制作用及其機制[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會脾胃病分會第十九次全國脾胃病學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2007年

10 劉文超;任軍;張學(xué)庸;劉智廣;張曉楠;;防御素對胃癌細胞殺傷的體外實驗研究[A];2000全國腫瘤學(xué)術(shù)大會論文集[C];2000年

相關(guān)重要報紙文章 前8條

1 記者 陸葉清;發(fā)現(xiàn)抑制胃癌細胞的重要基因[N];上�？萍紙�;2010年

2 衣曉峰　喬蕤琳 記者 趙宇清;抑制胃癌細胞生長研究有新發(fā)現(xiàn)[N];黑龍江日報;2010年

3 記者 衣曉峰　通訊員 喬蕤琳;維生素E衍生物能抑制胃癌細胞生長[N];健康報;2010年

4 王振嶺;我國抑制胃癌細胞生長研究有重要發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2002年

5 王振嶺;抗癌藥抑制胃癌細胞生長研究獲重要發(fā)現(xiàn)[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

6 王振嶺;7種抗癌藥體外抑制胃癌細胞的研究有新發(fā)現(xiàn)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

7 張中橋;胃癌細胞MDR機制研究取得新進展[N];中國醫(yī)藥報;2007年

8 吳一福 蘇玉軍;白藜蘆醇可誘導(dǎo)胃癌細胞脫落凋亡[N];中國醫(yī)藥報;2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李雙玲;IGF-1通過抑制Fox01核保留促進胃癌細胞生長機制的研究[D];山東大學(xué);2015年

2 胡偉國;腫瘤相關(guān)成纖維細胞中Thy-1激活誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究[D];上海交通大學(xué);2014年

3 周韻斕;應(yīng)激條件下胃癌細胞高表達線粒體活性氧和前梯度蛋白2促進腫瘤進展的研究[D];上海交通大學(xué);2014年

4 徐同鵬;SP1誘導(dǎo)的長非編碼RNA TINCR通過調(diào)控KLF2 mRNA穩(wěn)定性影響胃癌細胞的增殖與凋亡[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

5 王暢;miR-34a通過miR-34a-c-myc/Bmi-1負反饋通路負調(diào)控胃癌干細胞樣特性[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

6 羅貫虹;MGr1-Ag/37LRP參與PrP~C介導(dǎo)的胃癌細胞多藥耐藥[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

7 默董亮;人類解旋酶RecQL4調(diào)控胃癌細胞耐藥性分子機制研究[D];中國科學(xué)院北京基因組研究所;2016年

8 劉皎婧;PI3K/Akt/GSK3β/p190ARhoGAP/RhoA信號通路在Wnt5a誘導(dǎo)胃癌細胞遷移中作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

9 Muhammad Kamran（卡姆拉）;[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

10 王瑛;PKGⅡ?qū)PA誘導(dǎo)的胃癌細胞徖移及RhoA和Rac1激活的影響[D];江蘇大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 林光錟;CyclinA/CDK2介導(dǎo)BAG3 Ser291位點的磷酸化并影響胃癌細胞的增殖和凋亡[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 蔡洙哲;p12-LOX對胃癌細胞MKN-28的增殖和遷移的影響[D];延邊大學(xué);2015年

3 李龍;Her-2高表達對胃癌細胞侵襲、遷移的影響[D];長江大學(xué);2015年

4 趙婷婷;GPIbα對胃癌細胞粘附、遷移和侵襲能力的影響及其機制的初步探討[D];蘭州大學(xué);2015年

5 謝瑞霞;盤狀結(jié)構(gòu)域受體1調(diào)控上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響胃癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的研究[D];蘭州大學(xué);2015年

6 王東倉;NM23-H2通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌細胞的侵襲遷移[D];蘭州大學(xué);2015年

7 朱瑞雪;NDRG2基因?qū)ξ赴┘毎麗盒员硇偷挠绊慬D];鄭州大學(xué);2015年

8 董凱楠;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對胃癌細胞侵襲遷移能力的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

9 單爭爭;二甲雙胍在IL-6誘導(dǎo)胃癌細胞EMT中的作用[D];鄭州大學(xué);2015年

10 田莉;NM23-H2通過誘導(dǎo)自噬抑制胃癌細胞EMT的發(fā)生[D];蘭州大學(xué);2015年

，

本文編號：2336263