【摘要】：1研究背景和目的世界范圍內,食管癌死亡人數(shù)位居惡性腫瘤第六位;在我國,食管癌是第四位癌癥死亡原因;我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家,全世界每年一半以上的新發(fā)和死亡患者均發(fā)生在中國。食管癌預后較差,5年生存率僅20%左右。雖然各種治療方式進展迅速,但食管癌生存率多年來一直處于較低水平。早期食管癌預后很好,但臨床上90%以上患者確診時已是中晚期。中晚期食管癌生存狀況普遍較差,但仍有部分患者可以長期生存十年以上,有些可達三十年以上。如何找出影響患者生存期的原因、提高患者生存率是每位癌癥研究工作者的使命,也是眾多研究者關注的焦點問題之一。本研究在大樣本量流行病學調查的基礎之上進行大規(guī)模生存期隨訪,試圖通過生存分析找出生存期的影響因素,為臨床食管癌防治提供堅實的科學依據(jù)。食管癌極強的地域性分布差異和顯著的家族聚集現(xiàn)象提示環(huán)境和遺傳因素均在其發(fā)病機制中起重要作用。有研究提示免疫防御機制在食管癌變過程中可能起到重要的作用;而人類的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)是與自身免疫密切相關的重要區(qū)域;本研究組前期的中國人食管鱗癌全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)共計發(fā)現(xiàn)了10個食管鱗癌易感單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點和8個相關易感基因;本研究組前期揭示了3個MHC區(qū)域的SNP和食管鱗癌相關,但未進行另外獨立樣本的驗證。本研究是在前期基礎之上,為了評估免疫因素對食管癌發(fā)病的影響,進一步擴大了樣本量,進行了MHC區(qū)域的食管癌GWAS研究,即經GWAS研究篩選出在MHC區(qū)域與食管鱗癌發(fā)病可能有關的SNP位點,并對這些SNP位點在另外獨立的樣本進行Taq Man驗證,進而確定在MHC區(qū)域與食管鱗癌高風險有關的SNP位點。2材料及方法2.1食管癌大樣本生存分析2.1.1研究對象鄭州大學第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室聯(lián)合多家醫(yī)院和科研院所進行食管癌大規(guī)模隨訪調查,采用現(xiàn)場調研、腫瘤登記、醫(yī)院核查和電話隨訪等方式收集患者資料。收集到40年跨度(1974-2013年)的食管癌患者資料共計61 012例,隨訪截止日期是2014年7月24日。1)研究對象的一般情況在生存期明確的61 012例患者中,男38 289例,最小年齡是15歲,最大年齡是104歲,平均年齡是59.876±9.480歲;女22 723例,最小年齡是24歲,最大年齡是99歲,平均年齡是60.548±9.513歲。2)研究對象的病理診斷在收集到患者的一般信息之后,即到各家患者診治醫(yī)院進行臨床信息和病理資料的核對,記錄下患者詳實的食管癌組織學類型、大體類型、浸潤深度、分化程度、食管癌部位、淋巴結轉移、病理分級、TNM分期等病理信息。2.1.2研究方法1)資料收集首先,對所有參與工作的調查員進行嚴格培訓,做到標準統(tǒng)一,采用問卷調查的方式獲取患者信息,內容主要包括患者的一般情況(姓名、性別、年齡、職業(yè)、學歷、民族、家庭詳細地址、患者或親屬聯(lián)系手機或電話號碼等),行為生活方式(吸煙史、飲酒史等),臨床特征(腫瘤家族史、患癌知情、就診日期和治療醫(yī)院等)等;其次,采用醫(yī)院病案和病理核查的方式收集患者臨床信息和病理資料,內容包括過敏史、HP感染、組織學類型、大體類型、食管癌腫瘤部位、腫瘤長寬厚、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、病理分級、TNM分期、治療方式和手術吻合方式等;最后,通過電話和家訪等方式對患者進行生存期隨訪,獲得預后信息。對收集到的所有資料進行科學整理,反復核對,逐步更新。2)生存分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件;采用Kaplan-Meier法分析單因素(性別、年齡、腫瘤家族史、大體類型、浸潤程度、淋巴結轉移等)對患者生存期的影響,計算Log rank P值;多因素分析則采用Cox回歸模型,將單因素有統(tǒng)計學意義的項目納入,綜合判斷影響預后的因素,計算P值、HR值和95%CI;檢驗標準α=0.05。2.2 MHC區(qū)域食管癌GWAS研究2.2.1研究對象研究對象來自本課題組食管癌GWAS的樣品,采用病例-對照實驗設計方法。在GWAS初篩階段,使用Illumina 610芯片對1 077例食管癌患者和1 733例對照進行基因分型,使用Illumina 660芯片對451例食管癌患者和374例對照進行基因分型。GWAS初篩共計3 635例,其中病例組1 528例(男921例,女607例,平均年齡61±19歲);對照組2 107例(男1 052例,女1 055例,平均年齡31±15歲)。在驗證階段采用Taq Man技術在另外獨立的2 026例患者和2 384例對照進行驗證。Taq Man驗證共計4 410例,其中病例組2 026例(男1 256例,女770例,平均年齡60±9歲);對照組2 384例(男1 198例,女1 186例,平均年齡50±11歲)。病例組均經組織病理學確診為食管鱗癌,對照組均經上消化道內鏡檢查顯示無早期食管癌和其它上消化道腫瘤。2.2.2研究方法1)GWAS初篩采用主成分分析(principal component analysis,PCA)的方法,排除遺傳學上偏倚度較大的人群。使用Illumina 610和660芯片對匹配的食管癌和對照組人群DNA進行全基因組SNP掃描分析。SNP位點排除標準:(1)在病例和對照組中樣本得率(call rates)95%;(2)對照組中最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)1%;(3)對照組中哈迪·溫伯格平衡律檢驗(Hardy-Weinberg equilibrium test,HWE)P10-7。按此標準排除不合格SNP后,初步篩選出在MHC區(qū)域有可能與食管鱗癌高風險有關的SNP。2)TaqMan驗證對初篩中篩選出的SNP位點進行再次篩選,Taq Man驗證選取SNP位點的標準:(1)在病例和對照組中MAF0.05;(2)對照組中HWE P≥0.001;(3)病例和對照組中GWAS分析(Cochran-Armitage趨勢檢驗)P10-4。采用此標準最后鎖定和食管鱗癌高風險可能有關的SNP位點。采用Taq Man熒光定量基因分型技術,將篩選出的MHC區(qū)域SNP位點在另外獨立的食管鱗癌和正常對照進行大樣本量的驗證。3)統(tǒng)計學分析計算在MHC區(qū)域檢出SNP的樣本得率、MAF和HWE。對質控后的數(shù)據(jù)用Plink1.03軟件進行分析;采用Cochran-Armitage趨勢檢驗,計算P值、OR值和95%CI,檢驗標準取α=0.05。3結果3.1食管癌大樣本量生存分析結果3.1.1一般情況對食管癌生存期的影響女性患者生存期長于男性(Log rank P=0.000);診斷年齡對食管癌患者預后有明顯影響,隨著診斷年齡的增大,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);民族對食管癌患者生存期沒有影響(Log rank P=0.268);學歷對食管癌患者生存期有明顯影響(Log rank P=0.000);職業(yè)對食管癌患者生存期有重要影響(Log rank P=0.000)。3.1.2行為生活方式對食管癌患者生存期的影響吸煙史對食管癌患者生存期有顯著影響,有吸煙史者生存期較無吸煙史者明顯縮短(Log rank P=0.000);飲酒史對食管癌患者生存期影響顯著,有飲酒史者生存期較無飲酒史者顯著縮短(Log rank P=0.000)。3.1.3高低發(fā)區(qū)對食管癌患者生存期的影響食管癌高低發(fā)區(qū)對患者生存期影響明顯,高發(fā)區(qū)患者生存期明顯長于中、低發(fā)區(qū)患者(Log rank P=0.000)。3.1.4臨床特征對食管癌患者生存期的影響腫瘤家族史陽性患者的生存期顯著長于家族史陰性患者(Log rank P=0.000);血型對食管癌患者生存期無明顯影響(Log rank P=0.996);過敏史對食管癌患者生存期無明顯影響(Log rank P=0.148);單雙眼皮對食管癌患者生存期有顯著影響(Log rank P=0.003);HP感染對食管癌患者生存期無明顯影響(Log rank P=0.328);食管癌患者HBV感染陽性和陰性間生存期無差異(Log rank P=0.102);而HCV陽性患者生存期顯著長于陰性者(Log rank P=0.001);HIV陽性患者生存期明顯長于陰性者(Log rank P=0.003)。3.1.5病理因素對食管癌患者生存期的影響食管鱗癌和癌肉瘤患者生存期長于食管腺癌,食管小細胞癌生存期最短(Log rank P=0.000);不同腫瘤部位患者在總體生存期上差異有顯著統(tǒng)計學意義,中下段食管癌患者生存期長于上段癌,頸段癌患者生存期最短(Log rank P=0.000);腫瘤長徑對食管癌患者生存期有顯著影響,隨著腫瘤長徑的不斷增長,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);食管癌腫瘤寬度也對患者生存期有明顯影響,隨著腫瘤寬度的不斷增長,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);腫瘤厚度也對食管癌患者生存期有顯著影響,隨著腫瘤厚度的不斷增長,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);不同大體類型患者在總體生存期上差異有統(tǒng)計學意義(Log rank P=0.000);不同分化程度的食管癌患者生存期差異有顯著性意義,分化程度越差,生存期越短(Log rank P=0.000);浸潤程度是食管癌患者生存期的重要影響因素,隨著T分期的逐步加深,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);無淋巴結轉移的食管癌患者生存期顯著長于有淋巴結轉移的患者(Log rank P=0.000);隨著淋巴結陽性轉移個數(shù)的增多,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);淋巴結切除總數(shù)也對食管癌患者生存期有顯著影響(Log rank P=0.000);隨著病理分級的逐步上升,患者生存期逐步縮短(Log rank P=0.000);早期癌患者生存期顯著長于食管癌中期患者,晚期患者生存期最短(Log rank P=0.000)。3.1.6治療因素對食管癌患者生存期的影響治療方式對食管癌患者生存期有顯著影響(Log rank P=0.000);手術吻合方式對食管癌患者生存期有顯著影響,頸部吻合術生存期長于弓上吻合,弓下吻合生存期最短(Log rank P=0.000);不同手術開胸方式患者生存期無差異(Log rank P=0.655);患食管癌知情者的生存期顯著長于患癌不知情者(Log rank P=0.000);不同治療年代的食管癌患者間的生存期差異有統(tǒng)計學意義(Log rank P=0.000)。3.1.7 Cox回歸結果女性是影響食管癌預后的保護因素(p=0.000,HR=0.834,95%CI=0.799-0.870);診斷年齡是食管癌患者的獨立預后影響因素,≥70歲患者的死亡風險較40歲患者明顯增加(P=0.000,HR=1.856,95%CI=1.487-2.317);腫瘤部位是食管癌患者的獨立預后影響因素,下段癌患者較頸段癌患者死亡風險明顯減低(P=0.006,HR=0.609,95%CI=0.426-0.869);分化程度是食管癌患者的獨立預后影響因素,未分化癌患者的死亡風險較高分化癌患者明顯增加(P=0.002,HR=1.503,95%CI=1.155-1.957);浸潤程度是食管癌患者的獨立預后影響因素(P=0.000,HR=1.372,95%CI=1.323-1.423);淋巴結轉移是食管癌患者的預后危險因素,無淋巴結轉移患者較有淋巴結轉移者死亡風險顯著降低(P=0.000,HR=0.679,95%CI=0.626-0.737);病理分級是食管癌患者的獨立預后影響因素,IV級食管癌患者的死亡風險較0級患者明顯增加(P=0.007,HR=3.169,95%CI=1.361-7.378);治療年代是食管癌患者的獨立預后影響因素,近五年(2009-2013年)治療的食管癌患者死亡風險較早十年(1974-1983年)治療的患者明顯增加(P=0.000,HR=4.145,95%CI=2.911-5.902)。3.2 MHC區(qū)域食管癌GWAS研究結果3.2.1食管癌GWAS初篩的MHC區(qū)域結果通過對1 528例病例和2 107例對照的PCA后,去除偏離的樣品,得到遺傳學上匹配的1 528例病例和1 056例對照的人群。對匹配人群的DNA進行全基因組SNP掃描,在MHC區(qū)域共檢測出6 252個SNP位點。通過質量控制有2 533個SNP位點進入下一步的分析。3.2.2 TaqMan驗證結果經過驗證選取SNP位點的標準,去除不合格的SNP位點后,在MHC區(qū)域鎖定5個可能與食管鱗癌高風險有關的SNP位點,分別是:rs17533090(P_(GWAS)=1E-05),rs35399661(P_(GWAS)=6E-06),rs1536501(P_(GWAS)=9E-04),rs911178(P_(GWAS)=6E-04)和rs6901869(P_(GWAS)=3E-05)。在對2 026例病例和2 384例對照的Taq Man驗證后,驗證出1個有意義的SNP位點:rs911178(P replication=1.41E-22),定位于6p22.1,在SCAN domain containing 3(SCAND3)上游35-kb的位置。4結論4.1性別、診斷年齡、食管癌部位、腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結轉移、病理分級和治療年代是食管癌患者的獨立預后影響因素;吸煙史、飲酒史、高低發(fā)區(qū)、腫瘤家族史、組織學類型、腫瘤長徑、寬度、厚度、大體類型、淋巴結轉移陽性個數(shù)、臨床分期、治療方式、手術吻合方式和食管癌患者生存期相關;生存分析對食管癌臨床防治提供有力依據(jù)。4.2 MHC區(qū)域rs911178(SCAND3基因)和食管鱗癌高風險顯著相關;本研究加深了對食管鱗癌發(fā)病中MHC區(qū)域作用的認識,為建立高危人群篩查的手段和方法提供了非常重要的線索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：2328473