【摘要】：目的：1.體外實驗建立高轉移潛能人肝癌細胞MHCC97H和低轉移潛能人肝癌細胞MHCC97L的常氧和缺氧細胞模型,觀察在常氧和缺氧條件下羅勒多糖對兩種細胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力的影響,并進一步研究羅勒多糖對上皮間質轉化(EMT)相關基因、蛋白的影響,探討羅勒多糖抗腫瘤轉移的作用機制。2.體內實驗建立MHCC97H肝癌細胞裸鼠皮下荷瘤模型和walker-256細胞大鼠移植性肝癌模型,并對移植性肝癌大鼠進行肝動脈結扎術(HAL),造成腫瘤組織缺氧,觀察羅勒多糖對兩種模型腫瘤的影響,通過體內實驗探討羅勒多糖抗腫瘤轉移作用與上皮間質轉化(EMT)的關系。方法：1.采用濃度為200μmol·l-1的二氯化鉆(CoCl2)誘導細胞體外缺氧,建立MHCC97H和MHCC97L細胞缺氧模型,細胞在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)。常氧條件下將兩種細胞分別分為正常組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,缺氧條件下將兩種細胞分為正常組、缺氧模型組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,分別給予200、400和800μg·ml-1的羅勒多糖作用24小時,MTT法檢測常氧和缺氧條件下羅勒多糖對細胞增殖能力的影響,劃痕實驗檢測羅勒多糖對細胞遷移能力的影響,transwell小室實驗檢測羅勒多糖對細胞侵襲能力的影響,實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測羅勒多糖對細胞HIF-1 a、E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、Vimentin、 VMP1和ZO-1 mRNA表達水平的影響,Western-blot法檢測羅勒多糖對細胞中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表達水平的影響。2.將MHCC97H細胞接種于裸鼠右側肋腰部皮下,建立裸鼠皮下荷瘤模型,造模成功后根據(jù)腫瘤體積隨機分為五組：模型組、索拉非尼組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,分別給予生理鹽水、索拉非尼(50mg·kg-1·d-1)、低、中、高劑量羅勒多糖(100、200、400mg·kg-1 · d-1)灌胃,實驗結束后,測量皮下瘤重量,觀察各組腫瘤重量的變化,計算各藥物的抑瘤率,實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測羅勒多糖對腫瘤組織中HIF-1α、 E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1 mRNA表達水平的影響,Western-blot法檢測羅勒多糖對腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表達水平的影響。3.采用walker-256細胞建立Wistar大鼠移植性肝癌模型,造模成功進行肝動脈結扎術(HAL),并將實驗大鼠分為5組：模型組(不進行HAL)、HAL組、羅勒多糖低劑量組、羅勒多糖中劑量組和羅勒多糖高劑量組,手術成功后對模型組和HAL組給予生理鹽水灌胃,羅勒多糖低、中、高劑量組給予羅勒多糖(75、150、300mg·kg-1·d-1)灌胃,實驗結束后,測量肝臟腫瘤體積,計數(shù)腹腔腫瘤轉移灶數(shù)目,實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測肝臟腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、 Vimentin、VMP1和ZO-1 mRNA表達水平,Western-blot法檢測肝臟腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1和ZO-1蛋白表達水平。結果：1.濃度為200μmol·1的CoCl2作用MHCC97H和MHCC97L細胞24小時后,兩種細胞中HIF-1α mRNA表達水平顯著升高,與正常組比較有顯著性差異(P0.01)；在濃度為200μmol ·l-1的CoCl2的條件下,兩種細胞的存活率分別為77.76%和87.76%,細胞存活率相對較高；因此確定缺氧模型的造模條件為200μmol·l-1的CoCl2作用細胞24小時。常氧條件下,羅勒多糖對MHCC97H和MHCC97L細胞的增殖能力無明顯影響,各組細胞存活率都接近100%,與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義；中劑量羅勒多糖對MHCC97H細胞的遷移能力有抑制作用,與正常組比較具有顯著性差異(P0.05),羅勒多糖對MHCC97H細胞的侵襲能力、MHCC97L細胞的遷移能力和侵襲能力均無明顯作用,與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義；羅勒多糖可以上調MHCC97H細胞中E-cadherin、ZO-1 mRNA和蛋白的表達水平以及VMP1的蛋白表達水平,下調Vimentin mRNA的表達水平,與正常組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01)；羅勒多糖可上調MHCC97L細胞中E-cadherin的mRNA和蛋白的表達水平,與正常組比較有顯著性差異(P0.05,P0.01)。在缺氧條件下,MHCC97H和MHCC97L細胞的遷移和侵襲能力增強,與正常組比較有顯著性差別(P0.01)；羅勒多糖能抑制MHCC97H和MHCC97L細胞的增殖和遷移,并對MHCC97H細胞的侵襲能力具有抑制作用,與缺氧模型組比較具有顯著性差異(P0.01,P0.05)；在缺氧條件下,MHCC97H和MHCC97L細胞中HIF-1α、N-cadherin、 Vimentin的mRNA和蛋白表達水及β-catenin的蛋白表達水平升高,E-cadherin、VMP1的mRNA和蛋白表達水平降低；羅勒多糖能下調MHCC97H細胞中HIF-1 α、 N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白以及β-catenin的蛋白表達水平,上調E-cadherin和VMPl的mRNA和蛋白表達水平；而在MHCC97L細胞中,羅勒多糖能上調E-cadherin的：mRNA和蛋白表達水平,下調HIF-1α的mRNA和蛋白表達水平。2. MHCC97H細胞荷瘤裸鼠模型實驗結果顯示,羅勒多糖中、大劑量組荷瘤裸鼠體重明顯增加,與模型組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)；低、中、高劑量羅勒多糖和索拉非尼對裸鼠皮下腫瘤的抑瘤率分別為25.15%、14.72%、46.63%和55.58%,與模型組比較均無顯著性差異；羅勒多糖能下調腫瘤組織中HIF-1α、Vimentin、 N-cadherin的mRNA和蛋白以及β-catenin的蛋白表達,上調E-cadherin、VMP1、ZO-1的mRNA和蛋白的表達,與模型組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)；索拉非尼能上調腫瘤組織中E-cadherin的mRNA和蛋白表達,下調β-catenin的蛋白表達,下調N-cadherin mRNA的表達以及Vimentin mRNA和蛋白的表達,與模型組比較有顯著性差別(P0.01)。3.大鼠移植性肝癌模型結果顯示,肝動脈結扎術(HAL)能明顯縮小大鼠肝臟腫瘤體積,與不進行HAL術的模型組比較有顯著性差別(P0.05),但HAL術后腫瘤腹腔轉移灶數(shù)目(36±8個)明顯增多,與模型組(11±3個)比較有顯著性差別(P0.01)；經(jīng)HAL術后,腫瘤組織中HIF-1α、N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表達水平升高,β-catenin的蛋白表達水平升高,E-cadherin、VMP1的mRAN和蛋白表達水平降低；經(jīng)羅勒多糖干預后,羅勒多糖中、高劑量組腫瘤腹腔轉移數(shù)目明顯減少,分別為(22±4個)和(19±6個),與HAL組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)；羅勒多糖能下調腫瘤組織中HIF-1 α、N-cadherin Vimentin的mRNA和蛋白表達,下調β-catenin的蛋白表達,上調E-cadherin、VMP1的mRNA和蛋白表達,與HAL組比較有顯著性差別(P0.05,P0.01)。結論：1.缺氧能促進MHCC97H和MHCC97L細胞EMT的發(fā)生。在缺氧條件下,MHCC97H和MHCC97L細胞中HIF-1α表達上調,同時細胞中與EMT相關的E-cadherin VMP1的表達下調,β-catenin、N-cadherin和Vimentin的表達上調,引起EMT的發(fā)生,使細胞的運動能力和侵襲能力增強,加速了腫瘤的侵襲和轉移。2.羅勒多糖能抑制MHCC97H和MHCC97L細胞EMT的發(fā)生,這一作用與腫瘤缺氧微環(huán)境密切相關,并具有細胞差異性,對轉移能力強的MHCC97H細胞表現(xiàn)出更顯著的作用。對MHCC97H細胞,羅勒多糖能通過調節(jié)缺氧條件下HIF-1α的表達以及EMT相關的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1的表達,影響EMT的發(fā)生,抑制腫瘤細胞的侵襲和運動能力；而對MHCC97L細胞,羅勒多糖僅通過調節(jié)缺氧條件下HIF-1α的表達和EMT相關的E-cadherin的表達,抑制腫瘤細胞的運動能力,對侵襲能力無明顯作用。3.羅勒多糖和索拉非尼都能通過抑制EMT起到治療腫瘤的作用,但作用機制不同。羅勒多糖主要是通過改善腫瘤缺氧微環(huán)境,下調HIF-1α的表達,進而調節(jié)EMT相關的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Vimentin、VMP1、ZO-1表達,抑制EMT的發(fā)生；而索拉非尼不能改善腫瘤缺氧微環(huán)境,但其能通過調節(jié)E-cadherin、β-catenin和Vimentin的蛋白表達起到抑制EMT的作用。4.羅勒多糖能從多個方面對腫瘤產(chǎn)生影響,從而起到抗腫瘤轉移的作用。結合本實驗和前期研究結果發(fā)現(xiàn),羅勒多糖能改善腫瘤缺氧微環(huán)境、抑制腫瘤細胞EMT的發(fā)生、增強機體免疫力進而改善實驗動物生存狀態(tài),其抗腫瘤轉移是多靶點、多途徑共同作用的結果。
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【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2314513