【摘要】：目的胃癌作為常見的消化道惡性腫瘤,其死亡數(shù)量約占所有癌癥死亡人數(shù)的8%。我國是胃癌的高發(fā)國家,胃癌患者的五年生存率不到20%。盡管新型綜合治療模式如介入治療、分子靶向治療的應(yīng)用可在一定程度上改善胃癌患者的預(yù)后,提高其生存率,但臨床隨訪調(diào)查顯示胃癌患者仍有著較高的死亡率。伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展,人們?nèi)諠u認(rèn)識到轉(zhuǎn)錄信號分子及其相關(guān)調(diào)控因子在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中有著重要作用,因此尋找胃癌進(jìn)展過程中調(diào)控因子,明確其可能的作用機(jī)制和途徑,對改善胃癌預(yù)后,提高患者生存率有著重要意義。Sirtuin是NAD+依賴型第Ⅲ類組蛋白去乙�；�(histone deacetylase, HDAC),廣泛分布于機(jī)體中[1]。研究證實(shí)Sirtuin蛋白可通過調(diào)控基因穩(wěn)定性及腫瘤細(xì)胞能量代謝、改變腫瘤微環(huán)境等多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖分化遷移。SIRT6作為Sirtuin蛋白中的一員,體外及臨床研究顯示它可能具有一定的抑癌作用,查閱The Cancer Genome Atlas數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示約20%腫瘤患者可出現(xiàn)SIRT6表達(dá)缺失,但也有研究認(rèn)為在胰腺癌及乳腺癌中SIRT6具有致瘤作用。目前對SIRT6在腫瘤發(fā)生過程中的可能作用尚無明確定論,關(guān)于SIRT6在腫瘤發(fā)生發(fā)展中基礎(chǔ)性及應(yīng)用性研究較為匱乏,尤其是SIRT6在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用仍是空白,因此需進(jìn)一步的探討。"Warburg效應(yīng)”作為腫瘤細(xì)胞能量代謝的主要特征,表現(xiàn)為有氧糖酵解、脂肪酸合成及谷氨酰胺分解能力的增強(qiáng),以保證腫瘤細(xì)胞生長增殖遷移等過程中必需的物質(zhì)和能量的供應(yīng)。研究認(rèn)為"Warburg效應(yīng)”的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種抑癌因子及原癌因子表達(dá)水平密切相關(guān),這些抑癌因子及原癌因子參與了腫瘤細(xì)胞代謝途徑的再編程。SIRT6作為機(jī)體代謝功能的關(guān)鍵調(diào)控因子,特異性敲除肝臟SIRT6可導(dǎo)致小鼠糖酵解能力的增強(qiáng),線粒體呼吸能力減弱,證實(shí)SIRT6對機(jī)體代謝功能的調(diào)控作用與抑制糖酵解,促進(jìn)氧化磷酸化,維持機(jī)體糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子la (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是細(xì)胞代謝途徑轉(zhuǎn)換過程中重要的調(diào)控因子,其可影響多種糖酵解相關(guān)酶如PFK1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (glucose transporter 1, Glut1)等表達(dá),研究顯示SIRT6缺陷小鼠退行性變化與HIF11α介導(dǎo)的代謝途徑轉(zhuǎn)換有關(guān)。由此我們推測SIRT6可通過影響HIF-1α表達(dá)調(diào)控Warburg效應(yīng),最終實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞分化增殖活性的調(diào)控。因此本研究擬探討SIRT6在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能作用展開研究：1.明確胃癌患者病灶組織及癌旁正常組織中SIRT6和HIF-1α表達(dá)水平,分析其與胃癌患者臨床特征的相關(guān)性；2.明確胃癌患者病灶組織及癌旁正常組織中糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)水平,分析其與SIRT6和HIF-1α表達(dá)水平相關(guān)性;3.構(gòu)建SIRT6過表達(dá)SGC7901細(xì)胞,分析SIRT6過表達(dá)后SGC7901糖酵解的變化情況,明確其可能的作用機(jī)制。為今后SIRT6在胃癌治療中的應(yīng)用提供參考依據(jù)方法。1. SIRT6及HIF-1α在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)選取2013-2015年間,在山東省立醫(yī)院東院消化內(nèi)科接受診斷及治療、病理學(xué)確診為胃癌的患者標(biāo)本共40例,設(shè)置對照組和病灶組,對照組取胃癌病灶周邊健康胃組織,采集時(shí)對照組樣本與癌組織距離不得小于5 cm；病灶組為胃癌組織。免疫組化技術(shù)檢測胃癌病灶組織中SIRT6及HIF-1α的分布及表達(dá),RT-PCR和Western-blot法測定SIRT6及HIF-1α表達(dá)情況,分析其與胃癌患者臨床特征指標(biāo)的相關(guān)性。2.胃癌組織及癌旁組織糖酵解水平及與SRT6、HIF-1α相關(guān)性分析RT-PCR法測定胃癌組織及癌旁正常組織糖酵解相關(guān)代謝酶HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平,分析SIRT6及HIF-1α與]HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。3. SIRT6對胃癌細(xì)胞株SGC7901糖代謝功能的影響及機(jī)制探討利用胃癌細(xì)胞株SGC7901建立SIRT6過表達(dá)模型(pSIRT6),同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)空載體設(shè)為對照組(p Vector),測定SIRT6過表達(dá)SGC7901細(xì)胞株的增殖活性,TuNEL法檢測細(xì)胞凋亡水平,明確SIRT6過表達(dá)SGC7901細(xì)胞糖攝入及乳酸分泌能力,Western-blot法分析SIRT6過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)水平,RT-PCR法測定HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平。結(jié)果1.免疫組化檢測胃癌患者病灶組織及癌旁正常組織內(nèi)HIF-1α及SIRT6表達(dá)結(jié)果顯示,HIF-1α及SIRT6主要分布于細(xì)胞核內(nèi),胃癌患者組織中SIRT6陽性率明顯低于癌旁正常組織組；與癌旁正常組織相比,胃癌患者組織內(nèi)HIF-1α陽性率明顯增高(P0.05);與癌旁正常組織相比,胃癌患者病灶組織內(nèi)SIRT6 mRNA及蛋白表達(dá)水平表現(xiàn)為不同程度的降低,而HIF-1α的表達(dá)水平則明顯上調(diào)(P0.05)。2. HIF-1α表達(dá)水平與胃癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級、臨床TNM分期及浸潤深度相關(guān),但與患者年齡、性別無相關(guān)性；SIRT6表達(dá)水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級、臨床TNM分期及浸潤深度相關(guān),但與患者年齡、性別及腫瘤大小無相關(guān)性。3. Pearson correlation分析顯示胃癌組織中HIF-1α與SIRT6表達(dá)密切相關(guān)(P0.05)。4.40例胃癌患者中HK、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)上調(diào)病例數(shù)分別為27例、25例、29例和29例,占所有病患人數(shù)的67.5%、62.5%、72.5%和72.5%,與癌旁正常組織相比,病灶組織內(nèi)HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平明顯升高(P0.05); Pearson correlation分析顯示SIRT6與HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性,其R2值分別為0.6493、0.4082、0.6169和0.2667 (P0.05); HIF-la與HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)性,其R2值分別為0.3717、0.3075、0.5025和0.1892(P0.05)。5.SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+) SIRT6質(zhì)粒建立SIRT6過表達(dá)模型,CCK-8試劑盒分析SIRT6過表達(dá)SGC7901細(xì)胞增殖活性,結(jié)果顯示SIRT6過表達(dá)后可抑制SGC7901細(xì)胞的增殖活性,而pVector組和Parental組內(nèi)SGC7901細(xì)胞增殖活性無明顯差別。6. TUNEL法分析SIRT6過表達(dá)后SGC7901細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示pVector和Parental組內(nèi)未檢測到凋亡細(xì)胞,pSIRT6組內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)為32.60±2.54,與pVector和Parental組相比pSIRT6組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P0.05)。7. SIRT6過表達(dá)后SGC7901細(xì)胞的葡萄糖利用能力減弱,與pVector和Parental組相比,培養(yǎng)上清液中葡萄糖的相對含量增加(P0.05)。乳酸作為衡量糖酵解活性的關(guān)鍵指標(biāo),SIRT6過表達(dá)后SGC7901細(xì)胞中乳酸合成能力降低(P0.05),上清液中乳酸含量明顯減少,表明SIRT6過表達(dá)可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞糖酵解能力。8. SIRT6過表達(dá)后,SGC7901細(xì)胞中HK2、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平均發(fā)生不同程度的下調(diào)(P0.05),但PDK1表達(dá)水平卻未發(fā)生明顯改變,提示SIRT6過表達(dá)后可通過影響糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)對糖酵解途徑的調(diào)控。9. Western-blot法分析SIRT6過表達(dá)SGC7901細(xì)胞中HIF-la表達(dá)水平,與j pVector和Parental組相比,SIRT6過表達(dá)SGC7901細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。結(jié)論1.胃癌組織中SIRT6陽性率明顯低于癌旁組織組,SIRT6表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級、臨床TNM分期及浸潤深度相關(guān),但與患者年齡、性別及腫瘤大小無相關(guān)性。胃癌組織中HIF-1α陽性率明顯高于癌旁組織組,與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理分級、臨床TNM分期及浸潤深度相關(guān),但與患者年齡、性別無相關(guān)性。Pearson correlation分析結(jié)果證實(shí)胃癌組織中HIF-1α與SIRT6表達(dá)水平密切相關(guān)。2.胃癌患者病灶組織內(nèi)HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。SIRT6與HK2、PDK1、LDH5和GlutlmRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性。HIF-1α與HK2、PDK1、LDH5和Glutl mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)性。3. SIRT6過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞SGC7901增殖活性,促進(jìn)其凋亡,它可通過影響HIF-1α下調(diào)胃癌細(xì)胞SGC7901多種糖代謝酶的表達(dá),進(jìn)而影響SGC7901細(xì)胞的糖攝入和乳酸生成能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2313876