【摘要】：【目的】膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,約占原發(fā)性腦腫瘤的60%-70%。膠質(zhì)瘤生長部位特殊,手術(shù)不易全切,且對放療、化療均不敏感,故術(shù)后復發(fā)率高,常規(guī)治療效果不佳;而惡性膠質(zhì)瘤(如膠質(zhì)母細胞瘤)預后更差,半數(shù)生存期不足一年�？焖僭鲋澈蛷V泛遷移侵襲是惡性膠質(zhì)瘤的重要生物學特征,同時也是多基因、多通路調(diào)控異常的結(jié)果。葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域包含蛋白1(SND1)是一種進化上較為保守的蛋白,其可作為多通路的協(xié)同轉(zhuǎn)錄激活因子,并對RNA代謝起重要調(diào)節(jié)作用。最新研究顯示SND1在多種常見惡性腫瘤細胞(如乳腺癌、結(jié)腸癌等)中過表達,提示其功能異�；钴S可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。但是,膠質(zhì)瘤細胞中SND1表達水平是否異常,該異常與腫瘤良惡性級別有何關(guān)系,由此引發(fā)的SND1功能紊亂在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制如何,目前尚不清楚。本研究采用人膠質(zhì)瘤組織學標本及膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87MG及U251對上述問題進行了深入探討�！痉椒ā�1.采用免疫組織化學方法檢測147例不同級別膠質(zhì)瘤組織和20例非腫瘤對照腦組織SND1、RHOA、MMP2及Ki-67抗原的表達水平;結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),分析SND1、RHOA及MMP2表達水平之間的關(guān)系;結(jié)合臨床隨訪資料,分析SND1、RHOA、MMP2表達水平與患者總體和無癥狀生存期之間的關(guān)系。2.通過慢病毒感染建立穩(wěn)定沉默SND1的U87MG和U251亞細胞系(SND1-sh)和穩(wěn)定表達無義序列的對照亞細胞系(scramble),同時用SND1真核表達質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染U87MG和U251細胞(SND1組及pSG5組),并以非轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照(mock);采用Western blot檢測以上各組細胞中SND1的表達水平;采用MTT及克隆形成實驗檢測各亞細胞系和mock組細胞的增殖活性以及U251和其亞細胞系的克隆形成效率(CFE),采用transwell體外遷移侵襲實驗檢測各組細胞的遷移侵襲能力,以明確不同SND1表達水平對膠質(zhì)瘤細胞上述生物學行為的影響。3.利用qRT-PCR及Western blot檢測上述各組細胞SND1、RHOA及MMP2mRNA及蛋白表達水平,以明確SND1對RHOA和MMP2表達的調(diào)控作用;采用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)以及凝膠遷移率實驗(EMSA),在U87MG及U251中驗證snd1是否通過轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控的方式上調(diào)rhoa和mmp2的表達。4.分別采用流式細胞術(shù)(fcm)和westernblot檢測u87mg及u251細胞系及其snd1-sh和scramble亞細胞系細胞周期分布及關(guān)鍵周期素、周期素依賴激酶及其抑制因子的表達水平,明確敲低snd1對腫瘤細胞細胞周期分布和增殖的影響;分別利用rhoa特異性小干擾rna(rhoa-si)及其對照無義序列(scramble)與snd1真核表達質(zhì)粒(snd1)及其空載(psg5)共轉(zhuǎn)染u87mg及u251細胞系建立rhoa-si/snd1組、scramble/snd1組、rhoa-si/psg5組及scramble/psg5組,通過mtt檢測各組細胞增殖活性,通過westernblot檢測各組snd1、rhoa及關(guān)鍵周期素、周期素依賴激酶及其抑制因子的表達水平,以明確snd1促進膠質(zhì)瘤細胞細胞周期進展及增殖的分子機制。5.分別利用mmp-2特異性小干擾rna(mmp2-si)及其對照無義序列(scramble)與snd1真核表達質(zhì)粒(snd1)及其空載(psg5)共轉(zhuǎn)染u87mg及u251細胞系建立mmp2-si/snd1組、scramble/snd1組、mmp2/psg5組及scramble/psg5組,通過體外遷移侵襲實驗檢測各組細胞遷移侵襲能力,通過westernblot檢測各組snd1、rhoa、mmp2表達水平。6.利用westernblot檢測snd1-sh和scramble亞細胞系及mock組細胞mmp-2、c-jun、磷酸化c-jun(p-c-jun)水平;檢測rhoa-si/snd1組、scramble/snd1組、rhoa-si/psg5組和scramble/psg5組細胞遷移侵襲能力及c-jun、p-c-jun和mmp2的水平,以明確snd1促進膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的分子機制�！窘Y(jié)果】1.免疫組化結(jié)果顯示,各膠質(zhì)瘤組snd1、rhoa、mmp2及ki-67陽性標記指數(shù)(li%)均明顯高于非腫瘤對照腦組織,并均隨腫瘤的良惡性級別的升高而升高,各組間差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05~0.001)。相關(guān)分析顯示,snd1li%與ki-67、rhoa及mmp2li%均呈顯著性正相關(guān)(r=0.959~0.984,p0.001),這與tcga數(shù)據(jù)分析結(jié)果相同。kaplan-meier生存分析證實,snd1、rhoa及mmp2高表達患者的無癥狀生存時間和總生存時間均低于低表達患者(p0.0001);cox回歸分析顯示,snd1、rhoa及mmp2過表達均為影響患者生存時間的風險因素,其中snd1li%為患者無癥狀和總生存時間的獨立預測因子。2.westernblot檢測結(jié)果顯示,各snd1-sh亞細胞系的snd1表達水平均低于相應的mock組、psg5組及scramble亞細胞系,證實穩(wěn)定敲低snd1表達的u87mg及u251亞細胞株及其無義對照序列亞細胞株構(gòu)建成功,且snd1真核表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染可提高轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)snd1的表達水平。3.mtt檢測結(jié)果顯示,從體外培養(yǎng)4~5d起,snd1-sh亞細胞系的增殖活性明顯低于mock組和scramble亞細胞系(p0.05~0.01),u251-snd1-sh亞細胞系的cfe亦明顯低于各對照(亞)細胞系(p0.001),證實敲低snd1表達可抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖活性。體外遷移侵襲實驗結(jié)果證實,各snd1-sh亞細胞系的遷移和侵襲細胞數(shù)均明顯低于相應的scramble亞細胞系及mock和psg5組細胞(p0.05~0.01),而snd1組則明顯高于以上各組(p0.05~0.01),證實敲低snd1可有效抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移侵襲,而轉(zhuǎn)染外源性snd1可明顯提高腫瘤細胞的遷移侵襲能力。4.qrt-pcr和westernblot結(jié)果顯示,各snd1-sh亞細胞系snd1、rhoa及mmp2mrna及蛋白的表達水平均明顯低于相應的scramble亞細胞系及mock和psg5組細胞(p0.001),而snd1組三種mrna及蛋白的表達水平均明顯高于其它組(p0.001),證實敲低/過表達snd1可有效抑制/提高膠質(zhì)母細胞瘤細胞內(nèi)源性rhoa及mmp2mrna和蛋白的表達。chip及emsa實驗顯示snd1可特異性結(jié)合于rhoa及mmp2編碼基因的啟動子區(qū),證實snd1可作為轉(zhuǎn)錄共激活因子通過誘導rhoa及mmp2mrna的轉(zhuǎn)錄提高其蛋白的表達水平。5.fcm結(jié)果顯示,snd1-sh亞細胞系g0/g1期細胞比例明顯高于mock組及scramble亞細胞系,證實敲低snd1可通過誘導g1期阻滯抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖。westernblot結(jié)果顯示snd1-sh亞細胞系ccnd1(cyclind1)、ccne1(cycline1)及cdk4表達水平降低,而cdkn1b(p27kip1)水平升高。共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示:rhoa特異性sirna可在不改變細胞內(nèi)snd1表達水平的條件下模擬敲低snd1對ccnd1、ccne1及cdkn1b表達的影響;過表達snd1可在上調(diào)rhoa的同時上調(diào)ccnd1、ccne1、cdk4,并下調(diào)cdkn1b的表達水平,且該效應可被rhoa特異性sirna完全逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實,snd1通過誘導rhoa,實現(xiàn)對g1/s轉(zhuǎn)換關(guān)鍵周期素、周期素依賴性激酶及其抑制因子的調(diào)控,從而加速細胞周期進展,促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖。6.體外遷移侵襲實驗結(jié)果顯示,mmp2特異性sirna可在不影響snd1及rhoa表達的條件下模擬敲低snd1對膠質(zhì)母細胞瘤細胞遷移侵襲的影響;過表達snd1可促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移侵襲,該效應可被mmp2特異性sirna完全逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實snd1可通過上調(diào)mmp2促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移侵襲。7.SND1-sh亞細胞系c-Jun表達水平與相應mock組及scramble亞細胞系無顯著差異,但其p-c-Jun水平明顯低于后者,證實敲低SND1可抑制c-Jun的磷酸化。共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示:RHOA特異性siRNA可模擬敲低SND1對c-Jun磷酸化的影響并下調(diào)MMP-2的表達,抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移侵襲;過表達SND1可在上調(diào)RHOA表達的同時促進c-Jun的磷酸化和MMP-2表達,并促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移侵襲,且該效應可被RHOA特異性siRNA逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實,通過誘導RHOA表達提高RHOA/JNK/c-Jun通路的活性是SND1上調(diào)MMP2并促進膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的另一重要分子通路�！窘Y(jié)論】1.膠質(zhì)瘤細胞普遍存在SND1、RHOA及MMP2的異常高表達,三者的表達水平隨膠質(zhì)瘤良惡性級別的升高而升高,故其陽性標記指數(shù)均可作為評價膠質(zhì)瘤良惡性級別的輔助指標。膠質(zhì)瘤細胞SND1、RHOA及MMP2表達水平均與患者生存時間密切相關(guān),其中,SND1表達水平可作為患者預后的獨立預測因子。2.在膠質(zhì)瘤細胞中SND1是RHOA和MMP2表達的重要調(diào)控因子,SND1可直接結(jié)合于RHOA和MMP2基因的啟動子區(qū),并作為轉(zhuǎn)錄共激活因子誘導RHOA和MMP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄,從而提高內(nèi)源性RHOA和MMP2的表達水平。3.RHOA是SND1調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞增殖的重要靶點。SND1可通過上調(diào)RHOA提高腫瘤細胞cyclin D1、cyclin E1及CDK4的表達水平,并抑制p27Kip1的表達,從而加速G1/S轉(zhuǎn)換,促進膠質(zhì)瘤細胞增殖。4.MMP2是SND1調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的重要靶點。SND1不僅可直接上調(diào)MMP2,還可通過激活RHOA/JNK/c-Jun通路誘導MMP2表達,并最終提高膠質(zhì)瘤細胞的遷移侵襲能力。5.SND1表達異常升高是導致膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因,亦是膠質(zhì)瘤細胞獲得無限增殖和活躍遷移侵襲能力的重要分子機制。靶向沉默SND1表達可通過抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移侵襲發(fā)揮膠質(zhì)瘤抑瘤作用,有可能成為對惡性膠質(zhì)瘤進行有效干預的重要策略。此外,敲低RHOA及MMP2亦可發(fā)揮明確的膠質(zhì)瘤抑瘤作用,故亦可作為惡性膠質(zhì)瘤分子干預的有用靶點。6.本研究采用的慢病毒載體可有效感染膠質(zhì)瘤細胞并敲低SND1表達,為沉默SND1提供了有效的技術(shù)手段。研究過程中建立的穩(wěn)定敲低SND1的U87MG和U251亞細胞系和對照亞細胞系為進一步研究SND1對膠質(zhì)瘤生物學行為的影響提供了可靠的細胞模型。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4

【共引文獻】

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本文編號：2307111