【摘要】：第一部分目的:檢測橋接整合因子-1(bridging integrator-1,Bin1)在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞和正常人胚肺成纖維細胞2BS細胞中的表達情況,篩選出Bin1低表達的非小細胞肺癌細胞;構建Bin1穩(wěn)定過表達的慢病毒載體質粒,研究Bin1過表達對NSCLC細胞系H1975細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。方法:1采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantificational real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)方法和Western blot實驗檢測Bin1在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細胞肺癌細胞和人胚肺成纖維細胞2BS細胞中的表達情況,篩選出Bin1低表達的非小細胞肺癌H1975細胞。2構建攜帶Bin1基因的慢病毒載體p CDH-Bin1,體外以病毒轉染的方式將Bin1基因轉入H1975細胞(Bin1+組),并分別設置空載體組(p CDH組)和空白對照組(Con組),流式細胞術分別篩選出穩(wěn)定表達Bin1和空載體的H1975細胞,擴大培養(yǎng)后,經qRT-PCR和Western blot方法鑒定,獲得穩(wěn)定過表達Bin1的H1975細胞系。3利用MTT實驗和平板克隆形成實驗檢測Bin1對H1975細胞增殖能力的影響。4流式細胞術檢測Bin1對H1975細胞細胞周期的影響。5細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測Bin1對H1975細胞遷移和侵襲能力的影響。結果:1 qRT-PCR和Western blot實驗結果表明,與人胚肺成纖維細胞2BS細胞相比,H1975、H1650、A549中Bin1基因和蛋白的表達水平明顯低于2BS細胞中Bin1基因和蛋白的表達水平,其中H1975細胞中Bin1基因和蛋白表達量最低(P0.05),而H460中Bin1基因和蛋白表達量與2BS細胞相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。篩選出Bin1表達量最低的H1975細胞,用于后續(xù)實驗。2 qRT-PCR和Western blot實驗結果表明,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組H1975細胞中Bin1基因和蛋白表達水平顯著升高(P0.05),p CDH組和Con組相比,Bin1基因和蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明Bin1已成功轉入H1975細胞中。以流式細胞術篩選的方式獲得穩(wěn)定過表達Bin1的Bin1+細胞和穩(wěn)定表達p CDH載體的p CDH組細胞。3 MTT實驗結果表明,在H1975細胞中,Bin1+組細胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0543±0.021,0.1249±0.034,0.2348±0.027,0.3594±0.019,0.4923±0.031;p CDH組細胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0634±0.024,0.3549±0.037,0.4988±0.047,0.9857±0.019,1.524±0.053;Con組細胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分別為0.0619±0.029,0.3624±0.042,0.4874±0.039,0.9957±0.023,1.5097±0.046。與p CDH組和Con組相比,Bin1在48h、72h、96h、120h可以抑制H1975細胞的增殖活性(P0.05),而p CDH組和Con組細胞的增殖活性相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明Bin1可以抑制H1975細胞的增殖活性。平板克隆形成實驗結果表明,相同條件培養(yǎng)7天后,Bin1+組細胞克隆形成能力為p CDH組的59%(P0.05),為Con組的61%(P0.05),而p CDH組和Con組細胞的克隆形成能力相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。說明Bin1可以抑制H1975細胞的克隆形成能力。以上實驗結果表明Bin1可以抑制H1975細胞的增殖能力。4細胞周期實驗結果表明,Bin1+組細胞G0/G1期比例為(67.12±1.74)%,p CDH組細胞G0/G1期比例為(55.81±1.48)%,Con組細胞G0/G1期比例為(56.41±2.03)%,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組細胞G0/G1期比例顯著增加(P0.05),而p CDH組和Con組相比G0/G1期比例差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明Bin1+組細胞中DNA合成受限,阻止細胞從G0/G1期進入S期,進而誘導H1975細胞發(fā)生細胞周期阻滯。5細胞劃痕實驗結果顯示,Bin1+組細胞12h遷移距離為(25.3±2.6)μm,p CDH組細胞12h遷移距離為(58±5.2)μm,Con組細胞12h遷移距離為(60.21±4.2)μm;Bin1+組24h遷移距離為(58.7±3.8)μm,p CDH組24h遷移距離為(92.3±4.3)μm,Con組24h遷移距離為(89.7±5.8)μm。與p CDH組和Con組相比,Bin1+組遷移變化在12h及24h后均有統(tǒng)計學意義(P(27)0.05),且細胞遷移距離明顯縮短(P(27)0.05);而p CDH組和Con組相比,劃痕12h及24h后細胞遷移變化均無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明Bin1能夠抑制H1975細胞的遷移能力。Transwell實驗顯示,Bin1+組、p CDH組、Con組穿膜細胞數分別為50.50±3.15、124.00±4.25、130±4.37,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組穿膜細胞數明顯降低(P0.05),而p CDH組和Con組相比,兩者差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明Bin1能夠降低H1975細胞的侵襲能力。第二部分目的:檢測程序死亡因子受體(programmed death ligand 1,PD-L1)在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞和人胚肺成纖維細胞2BS細胞中的表達情況,通過過表達和RNA干擾兩種方式研究Bin1對免疫抑制因子PD-L1表達水平的影響,分析Bin1抑制NSCLC免疫逃逸的相關機制。方法:1 qRT-PCR和Western blot實驗檢測PD-L1在H1975、H1650、A549、H460四種人非小細胞肺癌細胞和人胚肺成纖維細胞2BS細胞中的表達情況,并檢測Bin1對H1975細胞中PD-L1表達的影響。2構建Bin1-si RNA,將其轉染入人H460細胞(Bin1-si RNA組)中,并設置空白對照組(Con組),通過qRT-PCR及Western blot實驗檢測RNA干擾效果,同時用qRT-PCR、Western blot方法檢測敲除Bin1對PD-L1表達水平的影響。3構建c-MYC-si RNA,qRT-PCR和Western blot實驗檢測RNA干擾效果,并檢測敲除c-MYC對PD-L1表達水平的影響。結果:1 qRT-PCR和Western blot實驗結果表明,與人胚肺成纖維細胞2BS細胞相比,H1975、H1650、A549細胞中PD-L1基因和蛋白的表達水平明顯高于2BS細胞中PD-L1基因和蛋白的表達水平,其中H1975細胞中PD-L1基因和蛋白表達量最高(P0.05),而H460和A549細胞中PD-L1基因和蛋白表達量與2BS細胞相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結合第一部分第一個結果,篩選出Bin1表達量最低而PD-L1表達量最高的H1975細胞,用于后續(xù)實驗;qRT-PCR和Western blot實驗結果表明,與p CDH組和Con組相比,Bin1+組細胞中PD-L1表達水平明顯下調(P0.05),而p CDH組和Con組細胞中PD-L1表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),說明Bin1過表達可以抑制H1975細胞中PD-L1的表達水平。2 qRT-PCR和Western blot實驗表明,與Con組相比,Bin1-si RNA組H1975細胞中Bin1基因和蛋白表達水平顯著下降(P0.05),說明H1975細胞中的Bin1已經成功被敲低。與Con組相比,Bin1-si RNA組細胞中PD-L1水平明顯上調(P0.05),說明Bin1可以負向調控PD-L1的表達。3 qRT-PCR和Western blot結果顯示,與Con組相比,c-MYC-si RNA組H1975細胞中c-MYC基因和蛋白水平明顯下調(P0.05),表明H1975細胞中的c-MYC已經成功被敲低;與Con組相比,c-MYC-si RNA組H1975細胞中PD-L1基因和蛋白水平明顯下降(P0.05),說明Bin1可以通過失活c-MYC抑制PD-L1的表達進而抑制NSCLC的免疫逃逸。結論:1在人非小細胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纖維細胞2BS中,H1975細胞中的Bin1基因和蛋白表達水平最低;以慢病毒轉染的方法成功建立Bin1穩(wěn)定過表達的H1975細胞系。2 Bin1能夠抑制H1975細胞的增殖、遷移及侵襲能力。3在人非小細胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纖維細胞2BS中,H1975細胞中的PD-L1基因和蛋白表達水平最高;Bin1可以抑制H1975細胞中PD-L1的表達水平,敲低H1975細胞中c-MYC的表達水平可以顯著下調H1975細胞中PD-L1的表達水平,說明Bin1可以通過失活c-MYC途徑抑制非小細胞肺癌中PD-L1的表達。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 Yan-yan Chen;Liu-bo Wang;Hui-li Zhu;Xiang-yang Li;Yan-ping Zhu;Yu-lei Yin;Fan-zhen Lü;Zi-li Wang;Jie-ming Qu;;Relationship Between Programmed Death-ligand 1 and Clinicopathological Characteristics in Non-small Cell Lung Cancer Patients[J];Chinese Medical Sciences Journal;2013年03期

2 ;Identification of a novel splice variant of human PD-L1 mRNA encoding an isoform-lacking Igv-like domain[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年04期

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本文編號：2306212