發(fā)布時(shí)間：2018-10-31 14:14

【摘要】：急性胰腺炎發(fā)病率近年來呈不斷上升的趨勢(shì),新修訂的亞特蘭大標(biāo)準(zhǔn)將急性胰腺炎分為間質(zhì)水腫性胰腺炎和壞死性胰腺炎。壞死性胰腺炎是指胰腺實(shí)質(zhì)或胰腺周圍組織的壞死,單純胰腺組織壞死約占5%,單純胰腺周圍組織壞死約占20%,大部分患者同時(shí)合并胰腺及胰腺周圍組織壞死。三種類型的壞死性胰腺炎均可為無(wú)菌性炎癥,也可伴發(fā)感染。壞死性胰腺炎約占急性胰腺炎的10-20%,胰腺壞死與感染、器官功能障礙等諸多并發(fā)癥相關(guān),導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率明顯增加,因此患者總體預(yù)后差。急性胰腺炎的自然病程主要分為以炎癥反應(yīng)為主要特征的第一階段以及以感染和膿毒血癥為主要特點(diǎn)的第二階段。壞死并發(fā)感染會(huì)使患者死亡率明顯升高。因此,在急性胰腺炎第一階段通過實(shí)驗(yàn)室檢查或臨床指標(biāo)早期評(píng)估患者預(yù)后,對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)的患者采取積極的治療措施,減少胰腺腺泡細(xì)胞壞死,對(duì)于改善患者的預(yù)后具有重要意義。MicroRNAs (miRNA)是一種單鏈非編碼RNA,長(zhǎng)度約為18-25nt,可通過與目的基因3'-UTR區(qū)結(jié)合抑制基因翻譯或促進(jìn)其降解,從而降低目的蛋白表達(dá)水平。miRNA雖然只占人類基因組的1%,但可調(diào)控約60%的蛋白表達(dá)基因。目前研究表明miRNA可參與細(xì)胞多種重要的生命活動(dòng)過程,包括增殖、分化及凋亡等;此外,miRNA在炎癥、腫瘤等疾病中也發(fā)揮重要作用。但目前尚無(wú)miRNA在壞死性胰腺炎中的作用報(bào)道。本研究通過構(gòu)建體內(nèi)壞死性胰腺炎模型,經(jīng)miRNA芯片篩選與胰腺腺泡細(xì)胞壞死明顯相關(guān)的miRNA,進(jìn)一步驗(yàn)證該miRNA在腺泡細(xì)胞壞死中的具體作用,并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探索。為將miRNA應(yīng)用于壞死性胰腺炎的診斷及治療提供初步證據(jù)。[目的]篩選與壞死性胰腺炎相關(guān)的miRNA,并驗(yàn)證其在胰腺腺泡細(xì)胞壞死中的作用及機(jī)制,為將miRNA應(yīng)用于壞死性胰腺炎的診斷及治療提供依據(jù)。[方法]1. 通過L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建壞死性胰腺炎SD大鼠模型,經(jīng)HE染色檢測(cè)模型是否構(gòu)建成功;經(jīng)miRNA芯片篩選與壞死性胰腺炎相關(guān)的miRNA。2.通過�；鞘懰�-3-硫酸醋二鈉鹽(Taurolithocholic Acid 3-sulfate Disodium Salt,TLC-S)處理胰腺腺泡細(xì)胞構(gòu)建壞死性胰腺炎細(xì)胞模型,檢測(cè)淀粉酶含量驗(yàn)證模型是否構(gòu)建成功。3 .在體外模型組及體外對(duì)照組AR42J細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimic miR-19b、miR-19b antisense oligonucleotide (miR-19b ASO)及陰性對(duì)照(negative control, NC),qRT-PCR驗(yàn)證miR-19b表達(dá)量改變;檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組AR42J細(xì)胞壞死率。4. qRT-PCR檢測(cè)間質(zhì)水腫性胰腺炎患者、壞死性胰腺炎患者及健康查體者臨床血液標(biāo)本中miR-19b含量,驗(yàn)證其與壞死性胰腺炎的關(guān)系。5. qRT-PCR檢沏測(cè)轉(zhuǎn)染 mimic miR-19b、miR-19b ASO 及 NC 的 AR42J 細(xì)胞中 IL-1β、IL-6 及 TNFα 的 mRNA 變化。[結(jié)果]1. HE染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L-精氨酸處理組大鼠有大量腺泡細(xì)胞壞死,說明壞死性胰腺炎SD大鼠模型構(gòu)建成功,命名為體內(nèi)模型組,對(duì)照組命名為體內(nèi)對(duì)照組;經(jīng)miRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)miR-19b表達(dá)量 與壞死性胰腺炎明顯相關(guān)。2.淀粉酶含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLC-S處理組AR42J細(xì)胞培養(yǎng)基上清中淀粉酶含量明顯升高,證明壞死性胰腺炎細(xì)胞模型構(gòu)建成功。構(gòu)建成功的壞死性胰腺炎細(xì)胞模型命名為體外模型組, 對(duì)照組命名為體外對(duì)照組。3.經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mimic miR-19b組miR-19b表達(dá)量較NC組明顯升高,miR-19bASO組miR-19b表達(dá)量較NC組明顯降低。在體外模型組細(xì)胞中mimic miR-19b組細(xì)胞壞死率較NC組明顯升高,miR-19b ASO組細(xì)胞壞死率較NC組明顯降低。4. qRT-PCR檢測(cè)臨床血液標(biāo)本中miR-19b含量發(fā)現(xiàn)間質(zhì)水腫性胰腺炎患者miR-19b含量較健康對(duì)照組明顯升高;壞死性胰腺炎患者miR-19b含量明顯高于間質(zhì)水腫性胰腺炎患者及健康對(duì)照組。 5.經(jīng) qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染 mimic miR-19b、miR-19b ASO 及 NC 的 AR42J 細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNFαmRNA變化。結(jié)果顯示相對(duì)于NC組細(xì)胞,mimicmiR-19b組 IL-1β、IL-6 及 TNFαmRNA 含量均明顯升高,而 miR-19bASO 組 IL-1β、IL-6及TNFα mRNA含量均明顯均明顯降低[結(jié)論]1. miR-19b可促進(jìn)壞死性胰腺炎患者腺泡細(xì)胞壞死的發(fā)生。2. miR-19b可通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6及TNFαmRNA水平介導(dǎo)壞死性胰腺炎炎癥反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞壞死。胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是臨床上腫瘤致死的主要原因之一,其起病隱匿、轉(zhuǎn)移出現(xiàn)早,約80%的患者在就診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì),手術(shù)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差,患者總體5年生存率低于6%,行手術(shù)切除并聯(lián)合輔助治療的患者中位生存時(shí)間僅24個(gè)月,明顯低于其他實(shí)體腫瘤患者中位生存時(shí)間。目前手術(shù)切除的PDAC患者主要的輔助治療方案是以吉西他濱為主的化療;近年研究報(bào)道對(duì)于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的PDAC患者采用聯(lián)合化療方案可延長(zhǎng)患者生存時(shí)間,聯(lián)合化療反應(yīng)率為23-31%,患者無(wú)病生存時(shí)間為5.5-6.6個(gè)月,總體生存時(shí)間為8.5-11個(gè)月。由此可見,聯(lián)合化療PDAC患者預(yù)后仍很差,且聯(lián)合化療使不良反應(yīng)率顯著增加,明顯降低患者生活質(zhì)量。早期診斷和早期切除是目前延長(zhǎng)患者生存時(shí)間最為有效的方法;PDAC預(yù)后不良與腫瘤異質(zhì)性高、對(duì)化療不敏感有直接關(guān)系,因此通過進(jìn)一步研究PDAC發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找早期診斷標(biāo)志物及更為有效的治療靶點(diǎn)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。MicroRNAs (miRNA)是非編碼的小RNA,可直接作用于靶向mRNAs抑制其翻譯或增加其降解從而降低表達(dá)水平。miRNA可作為調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)可成為重要的促癌或抑癌因子,影響腫瘤對(duì)化療反應(yīng)率。miRNA靶向藥物被視為腫瘤治療重要措施。miR-19b是miR-17-92集簇的重要促癌因子,研究表明其在乳腺癌、肺癌及胃癌等多種腫瘤中可通過直接作用于TP53、PTEN等重要抑癌基因發(fā)揮促癌功能,并可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo);miRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,可通過血液標(biāo)本檢測(cè),其在腫瘤早期診斷中的價(jià)值也受到越來越多的重視。但miR-19b在PDAC中的作用尚未明確。本研究主要探索miR-19b在PDAC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制,以進(jìn)一步明確PDAC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,同時(shí)為其早期診斷及治療提供新的思路。第一節(jié)miR-19b在PDAC增殖及轉(zhuǎn)移中的作用研究[目的]檢測(cè)miR-19b在PDAC細(xì)胞系及病人血液標(biāo)本中的表達(dá)量,并研究miR-19b在PDAC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲中的作用。[方法]1.通過qRT-PCR檢測(cè)人胰腺導(dǎo)管正常上皮細(xì)胞HPDE、人PDAC細(xì)胞系PANC1、MiaPaCa2、BxPC3及人PDAC轉(zhuǎn)移細(xì)胞系COL0357、FG中miR-19b的表達(dá)水平,初步探索miR-19b在PDAC中的功能。2.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院63例PDAC患者及50例健康查體者血液標(biāo)本,通過qRT-PCR檢測(cè)健康對(duì)照組及PDAC患者血液標(biāo)本中miR-19b表達(dá)水平,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-19b在PDAC中的功能。 3.構(gòu)建miR-19b穩(wěn)定高表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞系。通過Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-19b沉默和高表達(dá)的PDAC細(xì)胞遷移和侵襲能力改變,明確miR-19b對(duì)PDAC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影 響。4.通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-19b沉默及高表達(dá)后PDAC細(xì)胞增殖能力的變化,并通過Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)PDAC細(xì)胞增殖標(biāo)志物p21及p27在miR-19b沉默及高表達(dá)后表達(dá)量改變,明確miR-19b對(duì)PDAC細(xì)胞增殖能力的影響。[結(jié)果]1. qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示人胰腺導(dǎo)管正常上皮細(xì)胞HPDE中miR-19b表達(dá)量明顯低于人PDAC細(xì)胞系PANC1、MiaPaCa2、BxPC3及轉(zhuǎn)移細(xì)胞系COL0357、FG中miR-19b的表達(dá)水平,說明miR-19b在PDAC中可能具有促 癌作用。2.通過qRT-PCR檢測(cè)63例PDAC患者及50例健康查體者血液標(biāo)本中miR-19b表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)PDAC患者血液中miR-19b表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組,進(jìn)一步說明miR-19b在PDAC中 具有促癌作用。3.通過Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-19b沉默的PDAC細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降,miR-19b高表達(dá)的PDAC細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng),說明miR-19b可增強(qiáng)PDAC細(xì)胞遷移和侵襲能力。4.通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-19b沉默能夠明顯降低PDAC細(xì)胞增殖能力,miR-19b高表達(dá)可明顯增強(qiáng)PDAC細(xì)胞增殖能力;Western blotting結(jié)果顯示miR-19b沉默后PDAC細(xì)胞增殖標(biāo)志物p21及p27表達(dá)量明顯升高,miR-19b高表達(dá)后p21及p27表達(dá)量顯著降低。上述結(jié)果證實(shí)miR-19b可增強(qiáng)PDAC細(xì)胞增殖能力。[結(jié)論]1.miR-19b可促進(jìn)PDAC細(xì)胞遷移和侵襲;2.miR-19b可增強(qiáng)PDAC細(xì)胞增殖能力。第二節(jié)miR-19b促進(jìn)PDAC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制研究[目的]腫瘤轉(zhuǎn)移是造成PDAC患者死亡最為主要的原因,上述研究中我們已經(jīng)證實(shí)miR-19b可促進(jìn)PDAC細(xì)胞侵襲和遷移,本部分研究中我們將進(jìn)一步探索miR-19b增強(qiáng)PDAC細(xì)胞侵襲和遷移能力的具體機(jī)制。[方法]1.經(jīng)Western blotting檢測(cè)miR-19b沉默和高表達(dá)后PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性標(biāo)志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達(dá)改變,并經(jīng)sphere formation實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-19b沉默和高表達(dá)后PDAC腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的變化,探索miR-19b是否通過影響PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性促進(jìn)細(xì)胞 遷移和侵襲。2.經(jīng)microRNA.org和TargetScan預(yù)測(cè)miR-19b的靶向mRNA,結(jié)合前期研究報(bào)道中PDAC腫瘤干細(xì)胞特性調(diào)控常見分子和信號(hào)通路,篩選miR-19b影響PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性的可能分子;經(jīng)Western blotting檢測(cè)miR-19b高表達(dá)后所預(yù)測(cè)分子蛋白表達(dá)水平改變,選擇蛋白表達(dá)水平降低的分子進(jìn)一 步驗(yàn)證其功能。3.在miR-19b高表達(dá)的PDAC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染所選擇的靶基因cDNA以增強(qiáng)其表達(dá)水平,通過Western blotting檢測(cè)該基因高表達(dá)是否能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達(dá)后PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性標(biāo)志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達(dá)增強(qiáng),并經(jīng)sphere formation實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該基因高表達(dá)是否能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達(dá)后PDAC腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的增強(qiáng)。4.經(jīng)Tanswell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)所選擇的基因高表達(dá)能否逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達(dá)引起的細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。[結(jié)果]1.經(jīng)Western blotting檢測(cè)證實(shí)miR-19b沉默后PDAC腫瘤干細(xì)胞特性標(biāo)志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達(dá)明顯降低,miR-19b高表達(dá)后PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性標(biāo)志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達(dá)明顯增強(qiáng);經(jīng)sphere formation實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可見miR-19b沉默后PDAC腫瘤干細(xì)胞自我更新能力明顯降低,可見miR-19b高表達(dá)后PDAC腫瘤干細(xì)胞自我更新能力明顯增強(qiáng)。說明miR-19b可能通過增強(qiáng)PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。2.經(jīng)microRNA.org和TargetScan預(yù)測(cè)miR-19b的靶向mRNA,并結(jié)合前期研究報(bào)道中PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性調(diào)控常見分子和信號(hào)通路,篩選出3個(gè)miR-19b影響PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性的可能分子SOX2、PTEN及ABCG2;經(jīng)Western blotting檢測(cè)miR-19b高表達(dá)后SOX2、PTEN及ABCG2表達(dá)改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有PTEN蛋白表達(dá)水平下降,說明miR-19b可能通過靶向作用于PTEN進(jìn)而影響PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性。3.通過Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN高表達(dá)能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達(dá)后PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性標(biāo)志物(CD133、c-Met、FOXM1)的表達(dá)增強(qiáng),經(jīng)sphere formation實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTEN高表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達(dá)后PDAC腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的增強(qiáng)。結(jié)果說明miR-19b可通過降低PTEN表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性。4.經(jīng)Tanswell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTEN高表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-19b高表達(dá)引起的細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。說明miR-19b可通過靶向作用于PTEN降低其表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)PDAC細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性,并進(jìn)一步促進(jìn)PDAC細(xì)胞侵襲和遷移能力。[結(jié)論]1.miR-19b可通過增強(qiáng)PDAC腫瘤干細(xì)胞特性促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移;2.PTEN可介導(dǎo)miR-19b對(duì)PDAC腫瘤干細(xì)胞特性及轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R576;R735.9

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬進(jìn);中西醫(yī)結(jié)合治療壞死性胰腺炎3例[J];浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志;1996年03期

2 王東才,鄒玉環(huán);8例急性壞死性胰腺炎治療體會(huì)[J];華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年04期

3 喬士興,徐文科;手術(shù)治療急性壞死性胰腺炎25例體會(huì)[J];白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2001年03期

4 梁翠瑩;重癥壞死性胰腺炎病人的護(hù)理[J];海南醫(yī)學(xué);2002年01期

5 廖泉,趙玉沛;壞死性胰腺炎與感染出血的防治[J];臨床外科雜志;2003年06期

6 陸海燕;;壞死性胰腺炎術(shù)后的護(hù)理[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2007年22期

7 劉春暉;張苗;王鑫;蔣娜;孫殷;;重癥壞死性胰腺炎術(shù)后護(hù)理[J];黑龍江醫(yī)學(xué);2009年10期

8 ;壞死性胰腺炎的治療[J];臨床薈萃;2010年19期

9 陳偉軍;;重癥壞死性胰腺炎治療32例體會(huì)[J];吉林醫(yī)學(xué);2010年36期

10 吳驊;壞死性胰腺炎手術(shù)治療的效果[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊(cè));1986年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前4條

1 吳新鳳;;一例急性出血性壞死性胰腺炎患者的護(hù)理[A];全國(guó)外科、神經(jīng)內(nèi)外科護(hù)理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會(huì)議論文匯編[C];2006年

2 張昌慶;唐大千;楊建國(guó);趙金藝;方長(zhǎng)合;;手術(shù)治療急性出血性壞死性胰腺炎26例[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)胰腺外科學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2006年

3 汪訓(xùn)實(shí);高友兵;;暴發(fā)性壞死性胰腺炎的臨床表現(xiàn)和治療[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第10屆全國(guó)胰腺外科學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

4 黃彥云;孔小明;;禽流感的病理組織學(xué)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分第12次暨中國(guó)動(dòng)物病理生理學(xué)專業(yè)委員會(huì)第11次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 胡明星;MicroRNA-19b在壞死性胰腺炎及胰腺導(dǎo)管腺癌中的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉堯;超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺置管引流治療壞死性胰腺炎繼發(fā)感染的臨床觀察[D];吉林大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2302492