【摘要】：目的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的異質(zhì)性和缺乏適宜的生物學(xué)標記物,阻礙了對HCC預(yù)后的判定與治療方案的確定。上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)被認為是HCC早期的生物標志。本文的目的是研究EpCAM在HCC中的分布特點及表達水平與HCC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系,并探討EpCAM分子影響HCC生物學(xué)行為的機制。方法(1)構(gòu)建EpCAM原核及真核表達質(zhì)粒，并鑒定其表達與特征。(2)收集2006年4月～2009年7月確診為HBV相關(guān)性HCC的153例患者的臨床與隨訪數(shù)據(jù),應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫熒光方法檢測EpCAM胞外域(EpEX)胞內(nèi)域(EpICD)在HCC中的表達情況,回顧性分析其與HCC患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。(3)收集2013年8月～2014年1月34例行肝癌根治切除術(shù)的HCC患者的臨床與隨訪數(shù)據(jù),采集患者術(shù)前血漿及術(shù)中肝癌組織；應(yīng)用雙標準曲線相對定量熒光PCR方法檢測HCC組織中EpCAM mRNA的表達水平；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測HCC患者血漿中EpEX水平,分析其與HCC患者臨床特征及肝癌復(fù)發(fā)的關(guān)系。(4)應(yīng)用EpCAM胞外域及胞內(nèi)域序列的特異性shRNA干擾Huh7細胞EpCAM的表達，應(yīng)用CCK8法檢測細胞增殖能力、流式細胞儀檢測細胞周期分布及凋亡率、細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力、Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。結(jié)果(1)從HCC患者的肝癌組織標本中成功擴增出EpCAM全基因序列,成功構(gòu)建了EpCAM原核及真核表達質(zhì)粒。(2)153例HCC組織切片,EpEX膜表達陽性率16.99%,EpICD核、漿表達陽性率分別為59.48%、100%；HCC癌組織EpEX膜表達及EpICD核表達陽性率均高于癌旁組織(16.99% vs 7.84%,p=0.015；59.48% vs 15.03%,p0.001),而癌組織與癌旁組織EpICD胞漿表達陽性率無差異(100% vs98.69%,p=0.156)。EpEX膜表達及EpICD核表達與肝癌分期不相關(guān)(p=0.282,p=0.097)。HCC患者年齡與EpEX膜表達陽性率呈負相關(guān),患者年齡低者EpEX膜表達陽性率高,而患者年齡高者EpEX膜表達陽性率低。AFP水平與EpEX膜表達陽性率及EpICD核表達陽性率均呈正相關(guān),AFP水平高的患者HCC組織EpEX膜表達陽性率及EpICD核表達陽性率均高。EpEX+EpICD+、EpEX-EpICD-、EpEX+EpICD-EpEX-EpICD+四組HCC患者的中位無瘤生存期分別為：19、6、3、6個月；中位生存期分別為：46、42、28、28個月；四組HCC患者的無瘤生存率及總生存率均有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.008,p=0.041)；EpEX+EpICD-組易早期復(fù)發(fā),其無瘤生存率、術(shù)后總生存率低于EpEX-EpICD-組(p=0.007,p0.001)及EpEX+EpICD+組(P0.001,p=0.004)。HCC初次復(fù)發(fā)的特點為以肝內(nèi)復(fù)發(fā)為主,占總復(fù)發(fā)例數(shù)的62.20%：而EpEX-EpICD+組HCC發(fā)生血管和肝外復(fù)發(fā)的比例(50%)高于其它組別(EpEX+EpICD+組37.5%、EpEX-EpICD組24%，EpEX+EpICD-組0%)。(3)HCC癌組織及癌旁組織EpCAM mRNA表達量的歸一化值(中位數(shù)分別為13.50×10-4、57.00×10-4)均高于正常肝組織(中位數(shù)700×10-4,p0.05,p0.01),而癌旁組織mRNA表達量高于癌組織(p0.05)。HCC組織EpCAM mRNA高水平表達者多見于年輕和有鏡下血管癌栓的患者,且與低水平表達組相比更易復(fù)發(fā)(1年復(fù)發(fā)率52.94% vs 17.6%),無瘤生存率更低(P＝0.039)。HCC患者血漿EpEX檢出率為11.36%,可檢出EpEX濃度均值5703.92±8846.46pg/ml(61.49～18723.08 pg/m1),與正常人血漿中的EpEX水平(240.87±112.97pg/m1)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.34)。(4)應(yīng)用EpEX及EpICD特異性shRNA干擾Huh7細胞EpCAM的表達,導(dǎo)致細胞周期S期比例降低、G2期比例升高、細胞凋亡率升高,細胞增殖、遷移及侵襲能力減弱。結(jié)論(1)HCC組織EpEX+EpICD-與HCC患者早期復(fù)發(fā)及生存率降低相關(guān)；而EpEX-EpIC D+組HCC易于發(fā)生血管侵犯和肝外復(fù)發(fā)。(2)HCC患者肝癌組織EpCAM mRNA高水平表達可預(yù)測HCC的復(fù)發(fā)；由于HCC患者血漿樣本量及EpEX檢出率有限,對于HCC預(yù)后判斷的意義不大。(3) ShRNA干擾EpCAM的表達能夠降低肝癌細胞的體外增殖、遷移及侵襲能力,并影響細胞周期分布和凋亡率,為HCC的EpCAM抗體靶向治療提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2301813