【摘要】：背景肺癌(Lung cancer)在我國及世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首。據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織所發(fā)報告顯示,每年約180萬新發(fā)病例；五年生存率僅為15%,2012年全球肺癌死亡病例約160萬例,并且男性和女性肺癌死亡的病人分別約占全球癌癥死亡總?cè)藬?shù)的24%和14%。在我國,每年肺癌新發(fā)病例為67.6萬,死亡病例56.5萬。非小細胞肺癌在肺癌中占較大多數(shù),但許多非小細胞肺癌患者在診斷時已屬晚期,喪失了手術(shù)機會,多模式的化療成為非小細胞肺癌晚期重要的治療手段。以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療已成為非小細胞肺癌的一線化療方案,然而順鉑的耐藥性問題越來越突出,制約了抗腫瘤藥物療效的發(fā)揮,導(dǎo)致化療的失敗。探索非小細胞肺癌順鉑耐藥的發(fā)生機制,是近年來研究的熱點。CXCR4是G蛋白耦聯(lián)的七次跨膜受體,具有高度的保守性。其編碼基因位于染色體2q21,共有352個氨基酸組成。其胞外N端區(qū)與配體結(jié)合,胞內(nèi)區(qū)則與G蛋白偶聯(lián),C端含絲氨酸/蘇氨酸可磷酸化。通過參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在胚胎發(fā)育、炎癥及免疫反應(yīng)、血管生成、造血調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。自2001年Muller首先報道CXCR4在乳腺癌組織中高表達以來,研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌,前列腺癌和卵巢癌等多種腫瘤細胞普遍表達,在增長、遷移、侵襲過程中具有重要作用,通過與相對應(yīng)的特異性配體(CXCL12)結(jié)合,產(chǎn)生靶器官的特異性轉(zhuǎn)移。我們前期研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體4(CXCR4)在肺癌組織中高表達,并參與了肺癌的增殖和侵襲,導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。也有研究發(fā)現(xiàn)CXCR4的表達與部分腫瘤的耐藥相關(guān)。Hope等報道急性髓細胞性白血病通過高表達CXCR4進而促進G0期的急性髓細胞性白血病細胞亞群集聚在基質(zhì)層。而處于G0期的急性髓細胞性白血病細胞對化療藥物不敏感,進而產(chǎn)生耐藥。Li J等通過采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)CXCR4在上皮性卵巢癌的表達與順鉑耐藥呈正相關(guān),而通過RNA干擾技術(shù)降低上皮性卵巢癌細胞中CXCR4表達可逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的發(fā)生。但CXCR4是否參與肺癌順鉑耐藥的產(chǎn)生及相應(yīng)機制有待深入的研究。第一部分CXCR4表達與肺癌順鉑耐藥相關(guān)性的研究目的 比較CXCR4在肺癌順鉑耐藥組和敏感組的表達差異；比較CXCR4在肺癌A549順鉑耐藥細胞株(A549/DDP)及其親本細胞(A549)表達的差異。方法收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科于2012年5月至2015年10月行手術(shù)切除的64例非小細胞肺癌患者的病理標本及臨床資料,并進行隨訪。如無病生存時間小于12個月(包括12個月)被認為對鉑類耐藥,無病生存時間超過12個月者被認為是對鉑類敏感。運用免疫組織化學(xué)法分析CXCR4在64例非小細胞肺癌組織中表達：采用RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實驗分析CXCR4在肺癌A549順鉑耐藥細胞株(A549/DDP)及其親本細胞(A549)表達。結(jié)果本組獲得隨訪的共有64例患者,共有32例患者被認定為順鉑耐藥,即耐藥組32例,敏感組32例。在檢測的32例順鉑敏感的肺癌組織標本中,CXCR4的陰性表達率為40.6%,低表達28.1%,中等表達18.8%,高表達12.5%;而檢測的32例順鉑耐藥的肺癌組織中,CXCR4的陰性表達15.6%,低表達34.4%,中等表達21.9%,高表達28.1%,兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);耐藥組的染色評分1.63±1.07(而敏感組1.03±1.06),兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P.001)。RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實驗分析等實驗證實CXCR4在肺癌A549順鉑耐藥細胞株(A549/DDP)表達明顯高于其親本細胞(A549)的表達,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論CXCR4在順鉑耐藥的肺癌組織及細胞中高表達,可能具有潛在的促進肺癌順鉑耐藥作用。第二部分CXCR4對非小細胞肺癌耐藥性影響的研究目的擬通過RNA干擾技術(shù)觀察降低CXCR4的表達對肺癌細胞順鉑耐藥的影響,進一步探討CXCR4在肺癌順鉑耐藥中的作用。方法通過構(gòu)建靶向CXCR4的RNA干擾質(zhì)粒,并通過脂質(zhì)體系統(tǒng)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入人肺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP及其親本細胞株A549；應(yīng)用RT-PCR和Western blot分別檢測CXCR4 mRNA和蛋白表達水平；利用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測；Western blot檢測順鉑作用對人肺癌A549細胞和A549-DDP細胞CXCR4蛋白的影響；CCK-8法檢測細胞增殖；MTT法檢測RNA干擾技術(shù)沉默CXCR4表達對順鉑耐藥性的影響。結(jié)果成功構(gòu)建CXCR4干擾質(zhì)粒;siRNA沉默CXCR4的表達后,CXCR4在mRNA和蛋白表達水平受到明顯抑制。CCK-8法結(jié)果顯示si-CXCR4 A549和si-CXCR4 A549/DDP組細胞的受到抑制,并在培養(yǎng)的第48h和72h其增殖能力顯著低于si-NC A549和si-NC A549/DDP組；流式細胞術(shù)檢測CXCR4基因表達抑制后對A549、A549/DDP細胞凋亡的影響,與空載體對照組(11.16%和4.93%)相比,si-CXCR4 A549和si-CXCR4 A549/DDP結(jié)果顯示兩組組細胞的凋亡率分別為20.62%和6.64%%；MTT法檢測結(jié)果顯示抑制CXCR4基因表達后,與對照組A549/DDP相比,順鉑對si-CXCR4 A549/DDP細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯下降(14.837±0.099 μ g/m1和9.969±0.318μ g/m1),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：通過RNA干擾技術(shù)沉默CXCR4的表達可降低肺癌細胞順鉑耐藥的現(xiàn)象,進一步證實CXCR4參與了肺癌的順鉑耐藥。第三部分CXCR4通過CYP1B1調(diào)控肺癌細胞的耐藥性目的我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)肺癌順鉑耐藥與肺癌細胞的CXCR4的表達呈正相關(guān),而沉默CXCR4的表達可以降低A549順鉑耐藥細胞株的耐藥性,提示CXCR4與肺癌順鉑耐藥有著密切的關(guān)系。但CXCR4介導(dǎo)肺癌順鉑耐藥的作用機制不明晰。方法本研究通過生物信息學(xué)篩選分析數(shù)據(jù)集GSE42568中293例和數(shù)據(jù)集GSE41271中275例肺癌組織的基因組表達數(shù)據(jù),尋找能與CXCR4相互作用的蛋白介導(dǎo)順鉑耐藥；并通過免疫組化檢測二者在病理標本表達情況;western-blot檢測分析siRNA CXCR4轉(zhuǎn)染前后的肺癌A549/DDP細胞株的CYP1B1蛋白的表達情況。siRNA干擾CYP1B1的表達,并通過RT-PCR和Western blot分別檢測CYP1B1在mRNA和蛋白表達水平；MTT法檢測RNA干擾技術(shù)沉默CYP1B1表達對順鉑耐藥性的影響；流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。結(jié)果通過生物信息學(xué)方法得出CXCR4和CYP1B1參與肺癌耐藥；免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)CYP1B1在順鉑耐藥組肺癌組織中表達明顯高于順鉑敏感肺癌組織；采用Pearson相關(guān)分析方法分析CXCR4與CYP1B1在順鉑耐藥及敏感兩組肺癌組織中的表達呈正相關(guān)；western-blot檢測分析siRNA轉(zhuǎn)染前后的肺癌A549/DDP細胞株的CYP1B1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染空白載體的細胞相比,發(fā)現(xiàn)肺癌A549/DDP細胞株經(jīng)si-CYP1B1轉(zhuǎn)染后CYP1B1蛋白表達水平均明顯降低。RNA干擾CXCR4表達后,Western blot結(jié)果顯示CYP1B1在si-CXCR4 A549/DDP組細胞的表達受到抑制,顯著低于si-NC A549/DDP組。siRNA下調(diào)CYP1B1的表達后,CCK-8實驗結(jié)果提示與si-RNA NC對照組細胞相比,在順鉑作用下si-CYP1B1組細胞活性明顯降低；與空載體對照組(2.0%和0.7%)相比,流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示si-CYP1B1 A549和si-CYP1B1 A549/DDP兩組組細胞的凋亡率分別為7.5%和2.0%,凋亡有明顯增加。結(jié)論：CXCR4通過調(diào)控CYP1B1的表達參與肺癌順鉑耐藥的形成過程。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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本文編號：2288130