【摘要】：研究目的1.研究NKD1在肝癌中的表達(dá)情況及其臨床病理意義。2.研究NKD1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其調(diào)控機(jī)制。3.研究NKD1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響及分子機(jī)制。研究方法1.收集臨床肝癌組織樣本,提取組織中的蛋白質(zhì),通過免疫印跡的方法檢測NKD1蛋白在配對(duì)新鮮組織中的表達(dá)情況并統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)差異;2.收集臨床肝癌實(shí)驗(yàn)樣本,采用免疫組織化學(xué)染色的方法,檢測NKD1蛋白在肝癌組織中的表達(dá)定位和定量情況。根據(jù)免疫組化評(píng)估得分結(jié)果,采用卡方分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,探討NKD1的臨床病理意義;3.體外采用Transwell小室法研究“過表達(dá)”和“敲低”NKD1的蛋白表達(dá)后,肝癌細(xì)胞侵襲能力的改變情況。體內(nèi)通過建立裸鼠皮下移植瘤肺轉(zhuǎn)移模型研究NKD1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響;4.在過表達(dá)NKD1的同時(shí)過表達(dá)Rac1,通過功能恢復(fù)實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rac1在NKD1調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力中的關(guān)鍵性作用;采用免疫激光共聚焦的實(shí)驗(yàn)方法,檢測NKD1對(duì)肝癌細(xì)胞骨架重排的影響調(diào)控;5.采用免疫共沉淀和免疫熒光的方法檢測NKD1和Rac1蛋白的結(jié)合情況,通過范素化實(shí)驗(yàn)探究NKD1促進(jìn)Rac1降解的分子途徑;6.Real-time PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rac1可促進(jìn)NKD1的轉(zhuǎn)錄水平,通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測和細(xì)胞共轉(zhuǎn)染的方法證實(shí)Rac1對(duì)NKD1的轉(zhuǎn)錄激活是依賴于EZH2的;7.K-M生存統(tǒng)計(jì)分析Rac1和NKD1異常表達(dá)對(duì)肝癌患者不良預(yù)后的影響;8.采用CCK-8、Ed U實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn),分析NKD1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響,體外通過皮下移植瘤模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;9.在NKD1過表達(dá)的同時(shí),加入P53特異性的抑制劑,對(duì)比觀察細(xì)胞增殖指標(biāo)PCNA的改變情況,證實(shí)NKD1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖調(diào)控部分是依賴于P53的;Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測NKD1m RNA在肝癌中的表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)量與肝癌患者的腫瘤大小和生存時(shí)間之間的臨床相關(guān)性。研究結(jié)果1.通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),NKD1蛋白在肝癌中的表達(dá)量要明顯低于癌旁正常的肝組織(P0.01);2.通過對(duì)58例肝癌石蠟樣本進(jìn)行NKD1免疫組化染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NKD1在32例樣本中是處于低表達(dá),并且其低表達(dá)與肝癌患者的不良分化(P=0.003)、肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移(P=0.01)和腫瘤大小(P=0.011)密切相關(guān);3.基質(zhì)膠侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NKD1可以明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721和Huh7的遷移與侵襲,然而干擾NKD1的表達(dá)可促進(jìn)Hep G2的侵襲轉(zhuǎn)移能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),通過皮下注射過表達(dá)NKD1-SMMC-7721細(xì)胞的裸鼠肺部組織和肝內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和轉(zhuǎn)移率均明顯低于對(duì)照組(P0.05),提示NKD1可以在體內(nèi)外有效抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。4.免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NKD1過表達(dá)可以下調(diào)Rac1的蛋白水平,并且NKD1抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力是依賴于Rac1的。機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)NKD1可以通過調(diào)控Rac1進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞骨架重排。5.免疫熒光和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn),NKD1與Rac1在細(xì)胞漿中存有結(jié)合并縮短Rac1的蛋白半衰期。另外,NKD1還可以促進(jìn)Rac1的泛素化途徑依賴的蛋白降解;6.Rac1可以發(fā)過來促進(jìn)NKD1的基因轉(zhuǎn)錄,機(jī)制探討發(fā)現(xiàn),Rac1可以減少EZH2的蛋白表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)了NKD1的轉(zhuǎn)錄激活;7.肝癌組織中NKD1的m RNA水平明顯低于癌旁正常肝組織,而Rac1的蛋白水平在肝癌中是呈現(xiàn)相對(duì)高表達(dá)。生存分析發(fā)現(xiàn),Rac1和NKD1同時(shí)異常表達(dá)的肝癌病人手術(shù)后生存時(shí)間明顯低于其他病人(P=0.029);8.CCK-8、Ed U和克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NKD1負(fù)向調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖能力;體外皮下移植瘤模型也證實(shí)了這一點(diǎn);9.NKD1過表達(dá)后,肝癌中p53和p21蛋白表達(dá)增加,而PCNA的表達(dá)量明顯減少。當(dāng)加入p53特異性的抑制劑后,NKD1下調(diào)PCNA的作用明顯被消弱;10.NKD1m RNA水平與肝癌患者的腫瘤大小(P=0.002)和不良預(yù)后(P=0.029)明顯相關(guān)。研究結(jié)論1.NKD1蛋白在肝癌中的表達(dá)明顯低于癌旁正常肝組織,并且其低表達(dá)與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和大小密切相關(guān);2.NKD1負(fù)向調(diào)控肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,并且這一能力是依賴于Rac1的;3.NKD1在胞漿中與Rac1結(jié)合,并促進(jìn)其泛素化依賴的蛋白酶體降解;4.Rac1可以通過抑制EZH2的蛋白表達(dá)量進(jìn)而激活NKD1的轉(zhuǎn)錄;5.RAC1和NKD1異常表達(dá)的肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間明顯縮短;6.NKD1負(fù)向調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖能力,并且部分是依賴于p53的;7.NKD1m RNA水平與肝癌患者腫瘤大小和不良預(yù)后相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2276440