【摘要】：研究背景:肺癌是一種肺部組織內(nèi)細(xì)胞生長失控的疾病,其發(fā)病率和死亡率增長很快。根據(jù)美國的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),肺癌目前是全球癌癥死因的第一名,約占全部惡性腫瘤的26%,對(duì)人群健康和生命威脅很大,尤其是肺腺癌初診時(shí)大多已是晚期,血行轉(zhuǎn)移較早,多伴血栓形成。肺癌的病因至今尚不完全明確。蛋白質(zhì)Z(Protein Z,PZ)作為蛋白質(zhì)Z依賴的蛋白酶抑制劑(Protein Z dependent protease inhibitor,ZPI)的輔因子,主要在ZPI抑制FⅩa的過程中發(fā)揮間接抗凝作用,可以使ZPI對(duì)FⅩa的抑制作用增強(qiáng)1000倍以上。PZ缺乏時(shí),抑制FXa作用下調(diào),使凝血活性增強(qiáng),從而可增加血栓形成的危險(xiǎn)性。我們前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)隨著惡性腫瘤病程進(jìn)展,PZ血漿水平明顯下降,這可能是惡性腫瘤高凝狀態(tài)形成的一個(gè)新的機(jī)制。最新的研究發(fā)現(xiàn)PZ可以在乳腺癌組織、肺癌組織、結(jié)腸癌組織和胃癌組織中過表達(dá)或合成,認(rèn)為PZ可能在腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮抗凝血作用,從而可能影響到腫瘤的血管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移。為了探索PZ在惡性腫瘤細(xì)胞的過表達(dá)除了可能與惡性腫瘤血栓形成有關(guān)外,是否也和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān),我們選取了肺癌類型中最易早期轉(zhuǎn)移及血栓形成的肺腺癌作為研究對(duì)象來研究這一問題。目的:1.了解PZ蛋白及m RNA在肺腺癌的表達(dá)。2.獲得PZ蛋白在肺腺癌生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。3.探討PZ在肺腺癌發(fā)病、進(jìn)展、預(yù)后中的意義。方法:第一部分免疫組化方法檢測正常肺組織、肺腺癌組織PZ的表達(dá)收集正常肺組織、肺腺癌組織、癌旁組織標(biāo)本后,免疫組織化學(xué)方法分別檢測45例正常肺組織、45例肺腺癌組織及45例癌旁組織PZ的表達(dá)。完成統(tǒng)計(jì)分析,了解PZ蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與性別、分化及分期的關(guān)系。第二部分Western blot方法檢測肺腺癌組織、肺腺癌旁組織PZ蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分2組,共45例癌旁組織和45例肺腺癌組織。每個(gè)樣品收集完成后,液氮中浸置30分鐘,轉(zhuǎn)至-70℃冰箱保存。待全部樣品收集完成后,對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行裂解并用玻璃勻漿器勻漿,低溫超速離心提取組織蛋白,BCA法測定蛋白濃度。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)一步證實(shí)PZ蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與性別、分化及分期的關(guān)系。第三部分Western blot方法檢測正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ蛋白的表達(dá)培養(yǎng)人正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,胰酶消化細(xì)胞,培養(yǎng)基中和,轉(zhuǎn)移至離心管,低溫超速離心后棄上清,PBS液清洗沉淀,RIPA裂解液裂解,充分裂解后,低溫超速離心提取細(xì)胞蛋白。BCA法測定蛋白濃度,了解PZ蛋白是否在肺腺癌細(xì)胞高表達(dá)。第四部分Real time-PCR方法檢測肺腺癌組織及癌旁組織的PZ m RNA表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)分2組,5例正常肺組織和5例肺腺癌組織。-70℃冰箱取出標(biāo)本,解凍,玻璃勻漿器勻漿,低溫超速離心提取組織蛋白,BCA法測定蛋白濃度。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)一步證實(shí)PZ蛋白在肺腺癌中的表達(dá)情況及其與性別、分化及分期的關(guān)系。第五部分Real time-PCR方法檢測正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ基因m RNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分2組:正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞。培養(yǎng)正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,RT-PCR儀檢測各細(xì)胞PZ基因m RNA的表達(dá)量,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,了解PZ m RNA在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果:第一部分PZ在正常肺組織、肺腺癌組織、肺腺癌旁正常組織的表達(dá)1.PZ在肺腺癌組織中高表達(dá),在癌旁組織和正常肺組織中不表達(dá)或低表達(dá),PZ在巨噬細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associatedmacrophages,TAMs)和新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells,ECs)中高表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可見PZ表達(dá)積分隨腫瘤進(jìn)展明顯增高(P0.05);另外,低分化組同中高分化組比較得出PZ表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0005);不同性別對(duì)比,PZ表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第二部分Western blot方法檢測肺腺癌組織、肺腺癌旁組織PZ蛋白的表達(dá)同肺腺癌旁組織相比,肺腺癌組織中PZ表達(dá)明顯升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0003);早、中、晚各組相互對(duì)比,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可見PZ表達(dá)隨腫瘤進(jìn)展明顯增高(P0.05);此外,低分化組同中高分化組比較得出PZ表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0005);不同性別對(duì)比,PZ表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第三部分Western blot方法檢測正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ蛋白的表達(dá)A549、212102、GLC-82及16-HBE-T中PZ蛋白的表達(dá)各有差異,經(jīng)半定量密度分析得出PZ表達(dá)在A549、GLC-82呈高表達(dá),在A549尤為突出,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義第四部分肺腺癌組織和人正常肺組織PZ m RNA表達(dá)情況分別檢測5例肺腺癌組織和5例正常肺組織PZ基因和管家基因GADPH表達(dá)情況。由于樣本量不足,數(shù)據(jù)離散程度大,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,后續(xù)需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行檢測。(P0.05)。第五部分正常支氣管細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞PZ蛋白及m RNA的表達(dá)情況應(yīng)用熒光定量PCR儀器SYBR方法分別檢測肺腺癌細(xì)胞A549和正常細(xì)胞16-HBE PZ基因和管家基因GADPH表達(dá)情況,通過檢測得出,肺腺癌細(xì)胞A549 PZ基因m RNA表達(dá)量與正常對(duì)照組二者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.PZ蛋白在肺腺癌組中的表達(dá)明顯高于正常肺組織(癌旁組織),表明PZ可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。2.PZ蛋白在中晚期組的表達(dá)明顯高于早期組,表明其表達(dá)可能與肺腺癌的分期相關(guān),即肺腺癌越接近晚期,PZ蛋白表達(dá)可能越高。3.PZ蛋白在低分化組的表達(dá)明顯高于中高分化組,表明其表達(dá)可能與肺腺癌的分化程度相關(guān),即腫瘤的分化程度越低,PZ蛋白表達(dá)可能越高。4.PZ蛋白表達(dá)在性別組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能表明PZ在肺腺癌的表達(dá)與性別無相關(guān)性。5.1)PZ蛋白在肺腺癌組織和肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)均高于正常肺組織和正常支氣管上皮細(xì)胞。2)由于樣本量不足,數(shù)據(jù)離散程度大,PZ m RNA在肺腺癌組織和正常組織中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,后續(xù)需進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行檢測。3)PZ m RNA在肺腺癌細(xì)胞和正常支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)量均較低,這種矛盾的結(jié)果,原因不明。
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【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 關(guān)則兵;潘學(xué)誼;蔡小燕;;蛋白質(zhì)Z及凝血因子在惡性實(shí)體瘤患者中的變化[J];血栓與止血學(xué);2007年03期

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本文編號(hào)：2263230