【摘要】：背景:肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國以及世界其它地區(qū)的腫瘤性疾病中均排名第一位,已成為目前嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一。相比其他的惡性腫瘤,肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高、不易早期診斷、早期治療以及治療手段少等特點,因此目前肺癌患者的5年存活率仍不到15%。近年來的大量研究表明,深入研究肺癌的發(fā)生機制,尋找有效的生物標志物用于肺癌的早期診斷是降低肺癌死亡率的重要策略之一。肺癌發(fā)生除了與遺傳學異常改變相關外,表觀遺傳學改變在其中的作用越來越受到重視,尤其是DNA甲基化調(diào)控在肺癌的發(fā)生過程中的作用與機制的研究最為深入,其中抑癌基因通過高甲基化失活廣泛參與了肺癌的發(fā)生而被認為是較好的肺癌診斷標志物。我們前期通過全基因組篩選新發(fā)現(xiàn)一個在肺癌中高甲基化的基因TMEM196基因,通過文獻檢索發(fā)現(xiàn),目前國內(nèi)外還未見關于TMEM196基因甲基化在肺癌發(fā)生機制中的研究報道,而根據(jù)我們前期的實驗結果推測TMEM196基因在腫瘤發(fā)生過程中可通過高甲基化而失活,是一個候選的抑癌基因,因此有必要通過臨床肺癌組織標本進一步證實該基因在肺癌中甲基化的變化和解析該基因在腫瘤發(fā)生過程中的作用和功能,為其在臨床診斷、治療以及在其他疾病發(fā)生中的作用提供資料。目的:(1)明確TMEM196基因在肺癌細胞和肺癌組織的甲基化發(fā)生情況以及與患者臨床病理資料之間的關系;(2)明確TMEM196基因甲基化對其表達的影響及調(diào)控;(3)分析明確TMEM196基因在肺癌組織的蛋白表達與患者臨床病理資料和預后之間的關系;(4)初步分析TMEM196基因在腫瘤發(fā)生中的作用。實驗方法:(1)采用甲基化特異性PCR結合亞硫酸氫鹽修飾測序BSP方法分析檢測肺癌細胞和肺癌組織中TMEM196基因的甲基化發(fā)生情況;(2)采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(rt-pcr)和免疫組織化學染色的方法檢測肺癌細胞、肺癌組織和癌旁組織中tmem196基因的表達情況以及去甲基化藥物5-aza-dc處理前后肺癌細胞中tmem196基因的表達變化情況;(3)構建tmem196基因高表達和低表達細胞模型,利用cck-8和細胞克隆形成實驗等方法,初步分析該基因在腫瘤發(fā)生過程中的功能;(4)采用spss17.0統(tǒng)計軟件,通過卡方檢驗分析tmem196基因甲基化或表達與患者臨床病理資料之間的相關性,通過kaplan-meier和cox-regression生存分析方法分析tmem196基因表達與患者生存時間之間的關聯(lián)。實驗結果:(1)tmem196基因在10例肺癌腫瘤細胞中均可檢測出甲基化,而在正常肺上皮細胞hbe細胞中未檢測出甲基化。在肺癌腫瘤組織中其甲基化檢出率為61.2%(52/85),而在20例正常肺組織中該基因均未發(fā)生甲基化,甲基化發(fā)生率為0%,提示tmem196基因甲基化與肺癌的發(fā)生明顯相關;(2)tmem196基因甲基化與性別、吸煙史、年齡及肺癌病理分型無明顯相關性(p0.05),但與腫瘤臨床分期以及分化程度密切相關,隨著腫瘤分化程度降低,tmem196基因甲基化發(fā)生率逐漸升高(p=0.012),在iii期和iv期肺癌患者中tmem196基因甲基化率顯著高于i期和ii期患者(p=0.007),提示其甲基化是一個候選的診斷標志物;(3)tmem196基因在9例發(fā)生甲基化的肺癌細胞中均出現(xiàn)表達缺失或下降,而在正常肺組織中表達正常,同時在發(fā)生甲基化的肺癌組織中的表達也明顯下降,而在沒有發(fā)生甲基化的癌旁組織中的表達較高,表明tmem196基因在肺癌組織中的甲基化也與其表達相關。去甲基化實驗證實tmem196基因直接負調(diào)控其表達;(4)kaplan-meier單因素分析結果發(fā)現(xiàn),tmem196蛋白高表達的肺癌患者生存時間更長(p0.001)。但在臨床i+ii期肺癌患者中,tmem196蛋白高表達患者的生存時間長,而在臨床iii+iv期患者中tmem196蛋白表達與患者預后沒有顯著差別。cox-regression進行了多因素校正分析發(fā)現(xiàn),tmem196基因蛋白表達是一個獨立的預后因子(p=0.0003);(5)構建了tmem196高表達的細胞模型,利用細胞增殖實驗和克隆形成實驗均證實tmem196高表達可以明顯抑制腫瘤細胞增殖和克隆形成;而利用rna干擾tmem196基因的表達后,腫瘤細胞增殖達到恢復,這表明在體外tmem196基因可以抑制腫瘤細胞生長,是一個候選的抑癌基因。結論:(1)TMEM196基因的甲基化在肺癌組織和肺癌細胞中普遍發(fā)生,而在正常肺組織中未檢測到甲基化發(fā)生,它們的甲基化發(fā)生率存在明顯差別,表明TMEM196基因甲基化與肺癌發(fā)生密切相關;(2)TMEM196基因甲基化發(fā)生率隨著腫瘤分化程度降低而逐漸升高,在III期和IV期肺癌患者中TMEM196基因甲基化率顯著高于I期和II期患者,是一個候選的診斷標志物;(3)TMEM196基因甲基化直接負調(diào)控其表達。在腫瘤組織和腫瘤細胞中,TMEM196基因表達明顯下調(diào)或者不表達,同時TMEM196蛋白高表達有利于肺癌患者的預后,是肺癌患者的獨立預后因素;(4)TMEM196基因在體外能明顯抑制腫瘤細胞增殖,是一個候選的抑癌基因。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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1 趙歡;TMEM196基因在肺癌中甲基化及功能的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

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本文編號：2259172