【摘要】：第一部分基于RNA-seq技術(shù)的宮頸鱗癌和癌旁組織的差異表達(dá)基因分析目的：宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,居女性癌癥患者死亡原因的第4位。除HPV感染外,被感染細(xì)胞的基因組異常才能最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,因此與細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控異常在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中同樣具有重要作用。轉(zhuǎn)錄組是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)。本研究擬應(yīng)用RNA-seq技術(shù)全面分析宮頸鱗癌組織和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組,篩選出差異表達(dá)基因,進(jìn)而分析差異表達(dá)基因的相互作用、涉及的信號(hào)通路、以及差異表達(dá)基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性,尋找可能的宮頸鱗癌診斷的分子標(biāo)記物和靶向治療目標(biāo),為宮頸癌的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。方法：構(gòu)建cDNA文庫(kù)后,應(yīng)用RNA-seq全面分析3對(duì)宮頸鱗癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組,篩選出宮頸鱗癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)基因。應(yīng)用GO(Gene Ontology)方法分析差異表達(dá)基因的功能聚類,應(yīng)用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集性方法分析差異表達(dá)基因相關(guān)的信號(hào)通路。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),分析差異表達(dá)基因之間的相互作用,篩選出重要的差異表達(dá)基因。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化的方法驗(yàn)證宮頸鱗癌組織和癌旁組織的差異基因的表達(dá)水平,并分析差異基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性。結(jié)果：3對(duì)宮頸鱗癌組織和癌旁組織共有347個(gè)差異表達(dá)基因,包括104個(gè)表達(dá)一致上調(diào)的基因、148個(gè)表達(dá)一致下調(diào)的基因。347個(gè)差異表達(dá)基因被分為73個(gè)功能聚類,104個(gè)表達(dá)一致上調(diào)的差異表達(dá)基因被分為34個(gè)功能聚類,148個(gè)表達(dá)一致下調(diào)的差異表達(dá)基因被分為80個(gè)功能聚類。通過(guò)KEGG信號(hào)通路富集性分析,我們發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因富集到6條信號(hào)通路上,包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、補(bǔ)體系統(tǒng)及凝血相關(guān)信號(hào)通路、視黃醇代謝相關(guān)信號(hào)通路、趨化因子相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞色素p450外源性物質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路、黑素原生成相關(guān)信號(hào)通路。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)重要的差異表達(dá)基因,為RDH12,UBD, SAA1。與癌旁組織相比,RDH12基因在74.5%的宮頸鱗癌組織中表達(dá)下降,與腫瘤直徑及宮頸肌層浸潤(rùn)深度負(fù)相關(guān)。UBD基因在61.7%的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高,與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。SAA1基因在57.4%的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高,與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮頸肌層浸潤(rùn)深度正相關(guān)。結(jié)論：本研究首次利用RNA-seq技術(shù)對(duì)宮頸鱗癌和癌旁組織中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了全面分析,發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌與癌旁組織中共有347個(gè)差異表達(dá)基因,富集到6個(gè)信號(hào)通路上,其中差異表達(dá)基因RDH12, UBD, SAA1與宮頸鱗癌臨床病理因素相關(guān),可能成為宮頸癌診斷和治療的靶基因,但其在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。第二部分基于RNA-seq技術(shù)的宮頸鱗癌與癌旁組織的可變剪接分析目的：前體mRNA的可變剪接是真核生物蛋白質(zhì)多樣性的重要調(diào)控機(jī)制。mRNA異常剪接與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切,涉及細(xì)胞周期、代謝、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控�？勺兗艚釉趯m頸鱗癌中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬應(yīng)用RNA-seq技術(shù)全面分析宮頸鱗癌組織和癌旁組織中的可變剪接事件、可變剪接基因、可變剪接涉及的信號(hào)通路、可變剪接基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性,為宮頸癌的診治提供新的思路。方法：用RNA-seq技術(shù)分析4對(duì)宮頸鱗癌和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄本信息,用SpliceMap軟件檢測(cè)宮頸鱗癌組織和癌旁組織的可變剪接事件,使用Bowt ie軟件將每個(gè)檢測(cè)片段與人類基因組進(jìn)行比對(duì),篩選出宮頸鱗癌特異性的可變剪接事件。應(yīng)用KEGG信號(hào)通路顯著性富集方法分析可變剪接事件參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。根據(jù)4個(gè)宮頸鱗癌組織中的可變剪接事件mapped reads的數(shù)目,挑選出KLHDC7B和SYCP2基因,并用RT-PCR方法驗(yàn)證可變剪接基因KLHDC7B和口SYCP2在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平,并分析可變剪接基因與宮頸鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性。結(jié)果：根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù),4個(gè)宮頸鱗癌組織中共有35個(gè)特異性的可變剪接基因。KEGG信號(hào)通路富集性分析表明宮頸鱗癌特異性的可變剪接事件富集到16條信號(hào)通路上,包括代謝相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用相關(guān)信號(hào)通路、ras信號(hào)通路等。KLHDC7B基因存在可變5’剪接位點(diǎn),該基因在66.0%的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高,與腫瘤直徑正相關(guān)。SYCP2基因存在外顯子跳躍,該基因在38.2%的宮頸鱗癌組織中表達(dá)升高,與宮頸肌層浸潤(rùn)深度正相關(guān)。結(jié)論：本研究首次利用RNA-seq技術(shù)對(duì)宮頸鱗癌和癌旁組織轉(zhuǎn)錄本中的可變剪接事件進(jìn)行了全面分析,發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌中的可變剪接事件富集到16條信號(hào)通路上,篩選出宮頸鱗癌特異性的可變剪接基因共35個(gè),其中可變剪接基因KLHDC7B和SYCP2與宮頸鱗癌臨床病理因素相關(guān),可能成為宮頸癌診斷的分子標(biāo)記物和治療的靶點(diǎn),但其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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1 Patrick M.Glassman;Joseph P.Balthasar;;Mechanistic considerations for the use of monoclonal antibodies for cancer therapy[J];Cancer Biology & Medicine;2014年01期

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本文編號(hào)：2253018