【摘要】：背景缺氧微環(huán)境和上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腫瘤的浸潤、轉移、凋亡抵抗和耐藥有著密切的關系。EMT是缺氧誘發(fā)食管鱗癌生長和轉移的重要機制。信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of Transcription,STAT3)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要轉錄因子,磷酸化活化的STAT3,與缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)協(xié)同作用,調控細胞缺氧效應,參與腫瘤惡性轉化、轉移等進程。STAT3是否參與食管鱗癌缺氧誘導的EMT調控?其中有著怎樣的臨床意義?目前尚未見報道。本研究將著力解決這些問題。第一部分食管鱗癌組織pSTAT3、HIF-1α表達與EMT的關系及臨床意義目的:研究磷酸化STAT3(pSTAT3)、HIF-1α和E-cadherin三者的關系,及其對食管鱗癌臨床特征和預后的影響。方法:收集食管鱗癌根治切除標本106例,免疫組化檢測目標蛋白的表達,記錄患者復發(fā)及生存時間。比較食管正常上皮與食管鱗癌pSTAT3、HIF-1α和E-cadherin的表達,分析食管鱗癌組織三者表達與臨床病理特征的關系,kaplan-meier法分析生存數(shù)據(jù),log-rank檢驗和cox回歸方法分析影響生存的因素。結果:1.pstat3的表達食管鱗癌[71.7%(76/106)]較正常食管上皮[57.4%(58/101)]增加,hif-1α的表達食管鱗癌[73.6%(78/106)]較正常食管上皮[60.4%(61/101)]增加,e-cadherin的表達食管鱗癌[40.6%(43/106)]較正常食管上皮[100%(101/101)]下降,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05);2.食管鱗癌組織pstat3與hif-1ɑ表達正相關(γ=0.21),pstat3與e-cadherin負相關(γ=-0.20),hif-1ɑ與e-cadherin負相關(γ=-0.18),差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05);3.平均隨訪40.12個月,平均無病生存(dfs)36.71(95%ci32.78~40.64)個月,平均總生存(os)40.12(95%ci36.85~43.40)個月,多因素分析提示分期增加、pstat3陽性表達與不良dfs和os有關,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。第二部分缺氧對食管鱗癌細胞emt影響的研究目的:探明食管鱗癌中缺氧與emt的關系,缺氧對stat3表達的影響。方法:食管鱗癌細胞株te-1及ec-1,cocl2模擬缺氧環(huán)境,觀察細胞形態(tài)變化、劃痕實驗和transwell小室檢測細胞運動和侵襲的變化,realtimepcr檢測hif-1ɑ、e-cadherin、vimentin和stat3mrna,westernblot和免疫熒光檢測hif-1α、e-cadherin、vimentin、pstat3蛋白含量的變化。結果:1.缺氧狀態(tài)te-1及ec-1形態(tài)發(fā)生間質樣改變;2.ec-1細胞缺氧及常氧12h遷移率分別為(35.14±1.45)%和(13.12±3.25)%,te-1細胞分別為(30.65±1.91)%和(14.51±2.17)%;ec-1細胞缺氧及常氧12h侵襲率分別為(318.26±40.83)%和100%,te-1細胞分別為(300.56±16.83)%和100%:缺氧條件下的細胞遷移率和侵襲率與常氧條件相比,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05);3.e-cadherinmrna缺氧較常氧降低[缺氧和常氧24h相對mrnaec-1細胞分別為0.02(范圍0.01~0.03)和1,te-1細胞分別為0.02(范圍0.01~0.02)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);vimentinmrna缺氧較常氧增高[缺氧和常氧24h相對mrnaec-1細胞分別為37.07(范圍35.13~39.12)和1,te-1細胞分別為7.34(范圍5.42~9.94)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);stat3mrna缺氧較常氧增高[缺氧和常氧24h相對mrnaec-1細胞分別為31.48(范圍25.90~38.26)和1,te-1細胞分別為17.60(范圍14.68~21.12)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);hif-1αmrna變化不一[缺氧和常氧24h相對mrnaec-1細胞分別為1.38(范圍1.36~1.41)和1(p=0.01),te-1細胞分別為0.79(范圍0.76~0.82)和1(p=0.14)];4.缺氧較常氧e-cadherin蛋白表達下降[缺氧和常氧24h相對蛋白量ec-1細胞分別為(0.77±0.07)和1,te-1細胞分別為(0.55±0.05)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);缺氧較常氧vimentin蛋白表達升高[缺氧和常氧24h相對蛋白量ec-1細胞分別為(1.74±0.08)和1,te-1細胞分別為(1.86±0.35)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);缺氧較常氧hif-1α蛋白表達升高[缺氧和常氧24h相對蛋白量ec-1細胞分別為(2.67±0.37)和1,te-1細胞分別為(2.79±0.25)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);缺氧較常氧pstat3蛋白表達升高[缺氧和常氧24h相對蛋白量ec-1細胞分別為(2.45±0.29)和1,te-1細胞分別為(1.38±0.22)和1],差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。第三部分干擾stat3對缺氧誘導的食管鱗癌emt的影響及機制目的:研究stat3對于缺氧誘導的食管鱗癌emt的調節(jié)作用及具體機制。方法:構建stat3sirna質粒,轉染ec-1細胞,觀察缺氧條件細胞形態(tài)變化,檢測細胞遷移和侵襲變化,hif-1α、e-cadherin、vimentin蛋白和mrna、stat3mrna和pstat3蛋白的變化,chip方法檢測缺氧條件stat3與hif-1α啟動子的結合。結果1.westernblot驗證stat3sirna有效抑制stat3的表達;2.對照、空載體、stat3sirna組常氧條件下遷移率分別(17.94±0.62)%、(16.28±0.21)%、(9.90±0.97)%,缺氧條件下遷移率分別是(33.82±1.42)%、(35.90±1.51)%、(10.77±1.56)%,對照、空載體、stat3sirna組常氧條件下侵襲率分別為(100.00±0.00)%、(89.65±6.91)%、(33.60±4.17)%,缺氧條件下侵襲率分別為(276.08±19.88)%、(268.71±21.59)%、(109.95±11.96)%:stat3sirna明顯的抑制了常氧和缺氧條件下食管癌細胞的遷移和侵襲力,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);3.常氧條件vimentin相對mrna在stat3sirna組和空白對照組分別為0.05(范圍0.04~0.06)和1,hif-1α相對mrna在stat3sirna組和空白對照組分別為0.11(范圍0.09~0.13)和1,e-cadherin相對mrna在stat3sirna組和空白對照組分別為4.43(范圍4.18~4.70)和1;缺氧條件vimentin相對mrna在stat3sirna組和空白對照組分別為0.31(范圍0.23~0.42)和32.25(范圍30.48~34.13),hif-1α相對mrna在stat3sirna組和空白對照組分別為0.14(范圍0.12~0.15)和1.22(范圍1.15~1.29),e-cadherin相對mrna在stat3sirna組和空白對照組分別為4.06(范圍3.56~4.63)和0.06(范圍0.05~0.07):常氧和缺氧條件,stat3sirna明顯抑制vimentin、hif-1αmrna的表達,增高e-cadherinmrna的表達,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);4.常氧條件pstat3相對蛋白含量在stat3sirna組和空白對照組分別為0.49±0.06和1,hif-1α分別為0.68±0.06和1,vimentin分別為0.78±0.07和1,e-cadherin分別為3.21±0.16和1;缺氧條件pstat3相對蛋白含量在stat3sirna組和空白對照組分別為0.97±0.09和1.46±0.11;hif-1α分別為1.01±0.07和1.32±0.06;vimentin分別為0.84±0.10和1.76±.015,e-cadherin分別為3.40±0.37和0.81±0.03:常氧和缺氧條件,stat3sirna明顯抑制pstat3、hif-1α、vimentin蛋白的表達,增高e-cadherin蛋白的表達,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);5.chip提示stat3與hif-1α啟動子的結合。第四部分體內抑制stat3對食管鱗癌移植瘤hif-1α表達及emt的影響目的:研究食管鱗癌腫瘤體內缺氧的改變及emt變化,stat3sirna在體內對缺氧誘導的食管鱗癌emt的影響。方法:建立ec-1食管鱗癌裸鼠移植瘤模型,尾靜脈注射的方法分別給予stat3sirna及對照治療,觀察腫瘤的生長狀況,檢測不同組別移植瘤stat3、pstat3、hif-1α和e-cadherin的表達結果:1.生理鹽水對照組、空白載體對照組和stat3sirna治療組移植瘤的平均大小分別為(2.97±0.21)×103mm3、(2.80±0.39)×103mm3、(2.21±0.40)×103mm3,stat3sirna治療組較生理鹽水對照組和空白載體對照組腫瘤明顯縮小,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);2.stat3sirna治療組腫瘤組織表達stat3、pstat3、hif-1α、vimentin下降,表達e-cadherin增加。結論1.食管鱗癌pstat3、hif-1α表達較正常食管上皮升高,e-cadherin表達較正常食管上皮下降,三者表達具有相關性,pstat3陽性預示食管鱗癌預后不良。2.缺氧促使stat3表達上調,食管鱗癌細胞發(fā)生emt,細胞遷移和侵襲性增強。3.stat3經(jīng)由hif-1α調控缺氧誘導的食管鱗癌emt:抑制stat3可下調hif-1α表達,逆轉缺氧誘導的食管鱗癌細胞emt;stat3與hif-1α啟動子結合,從基因水平調控hif-1α的表達。4.食管鱗癌裸鼠移植瘤中存在hif-1α表達升高及emt現(xiàn)象;體內干擾stat3的表達可以抑制食管鱗癌組織hif-1α的表達及emt現(xiàn)象,并抑制腫瘤的生長。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：2252838