【摘要】：背景外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)存在于多種惡性腫瘤中,其檢測(cè)對(duì)于腫瘤早期診斷、預(yù)后分析、療效檢測(cè)以及個(gè)體化治療等眾多方面具有重要的臨床意義,并因能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)成為備受關(guān)注的“液態(tài)活檢”。目前CTCs檢測(cè)的主要方法包括依賴腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)的Cell Search系統(tǒng)及基于形態(tài)學(xué)富集的膜過(guò)濾技術(shù)(Isolating by size of epithelial tumor cells,ISET)。前者是基于細(xì)胞表面表達(dá)不同抗原標(biāo)志,將針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性抗體EpCAM、CK等包被于磁珠表面以完成腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別,借助外加磁場(chǎng)篩選富集CTCs。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于特異度較高,已有商品化的半自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備；但腫瘤特異性抗原表達(dá)的缺失會(huì)造成假陰性結(jié)果。后者是根據(jù)細(xì)胞大小的差異,利用過(guò)濾的方法將體積較大的腫瘤細(xì)胞篩選富集。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,分離獲得的CTCs具有活性可用于后續(xù)研究；但由于缺乏形態(tài)學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn),該富集技術(shù)特異性相對(duì)較差。我們課題組基于ISET原理,通過(guò)前期研究建立了改良ISET檢測(cè)CTCs技術(shù)體系,主要工作基礎(chǔ)包括：建立了改良ISET手工實(shí)驗(yàn)裝置、改良了染色方法、提高了腫瘤細(xì)胞截留率,研究結(jié)果表明該技術(shù)體系檢測(cè)效果較為理想,腫瘤細(xì)胞截留率可達(dá)80%以上,染色后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)可辨,能區(qū)分典型的CTCs與正常白細(xì)胞。但該技術(shù)體系仍然存在不足,首先是形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的缺乏致使CTCs的鑒定易受人為主觀因素影響,其次是過(guò)濾過(guò)程中時(shí)有堵孔現(xiàn)象出現(xiàn),致血樣過(guò)濾緩慢或不順暢。目的通過(guò)對(duì)前期建立的改良ISET檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系進(jìn)行優(yōu)化,聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù),建立一種新的檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的可靠方法；通過(guò)與CTC-Bi opsy、CellSearch兩種方法對(duì)比,驗(yàn)證ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)多種晚期腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)效果,探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法1.對(duì)課題組前期建立的改良ISET檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系進(jìn)行兩處優(yōu)化,即血樣預(yù)處理過(guò)程增加“紅細(xì)胞裂解”操作過(guò)程、增大濾膜孔徑。2.聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù),建立ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系,并通過(guò)檢測(cè)23侈Ⅲ/Ⅳ期腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行臨床預(yù)研究。3.建立ISET聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化技術(shù)體系,以上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物Twist、 Vimentin、E-Cadherin為檢測(cè)指標(biāo)驗(yàn)證上述23例臨床樣本中是否存在EMT現(xiàn)象。4.運(yùn)用ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)體系檢測(cè)肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌共計(jì)74例患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,通過(guò)與CTC-Biopsy、 CellSearch兩種方法對(duì)比,探討其臨床應(yīng)用可行性。結(jié) 果1.對(duì)課題組前期建立的改良ISET檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系進(jìn)行兩處優(yōu)化后,新技術(shù)體系過(guò)濾更順暢,染色更清晰可辨,腫瘤細(xì)胞截留率無(wú)明顯減低。2.通過(guò)聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù),建立了ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系。對(duì)23例Ⅲ-Ⅳ期腫瘤患者進(jìn)行外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CTCs陽(yáng)性9例(9/23,39.1%),EMT-CTCs陽(yáng)性3例(3/23,13.0%),CTM3例(3/23,13.0%)。3.建立了ISET聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化技術(shù)體系,對(duì)上述23例臨床樣本中檢測(cè)到的EMT進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Twist抗原表達(dá)陽(yáng)性1例,Vimentin抗原表達(dá)陽(yáng)性2例。4.通過(guò)檢測(cè)74例肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)總體陽(yáng)性檢出率(13/74,17.6%)介于CellSearch(9/74,12.2%)與CTC-Biopsy(14/74,18.9%)之間。進(jìn)一步對(duì)比分析,ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光方法與CellSearch方法CTCs總體陽(yáng)性檢出率有顯著性差異(χ2=10.21,p=0.007),前者檢出率高于后者。ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光方法與CTC-Biopsy方法CTCs總體陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著性差異(χ2=3.926,p=0.062),但兩者一致性較差(Kappa=0.230)。結(jié)論1.通過(guò)對(duì)課題組前期ISET技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù),建立了ISET-ICC檢測(cè)CTCs技術(shù)體系。2.通過(guò)細(xì)胞蠟塊-免疫組化技術(shù)體系,驗(yàn)證了ISET-ICC技術(shù)體系分離獲得的CTCs性質(zhì),證實(shí)了EMT的存在。3.通過(guò)與CellSearch、CTC-Biopsy兩種CTCs檢測(cè)方法對(duì)比,證實(shí)了ISET-ICC技術(shù)具有臨床應(yīng)用可行性,能夠用于肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌患者的CTCs檢測(cè)。4.ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)能檢測(cè)到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤微栓,而這兩種細(xì)胞是造成CellSearch假陰性的主要原因。5.ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)能夠輔助鑒定CTC-Biopsy方法富集的CTCs。
[Abstract]:Background Peripheral blood circulating tumor cells (CTCs) are present in many malignant tumors, and their detection has important clinical significance in many aspects such as early diagnosis, prognosis analysis, curative effect detection and individualized treatment, and can be detected in real time, The advantages of small wound and so on become the most important 鈥渓iquid biopsy鈥，

本文編號(hào)：2251683