【摘要】：目的:乳腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,不僅具有復(fù)發(fā)率高,轉(zhuǎn)移率高及死亡率高的特點(diǎn),其發(fā)病率也在逐年增加。隨著社會(huì)的發(fā)展科學(xué)的進(jìn)步,近年來(lái)乳腺癌的治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。雖然乳腺癌外科手術(shù)治療取得了良好的治療效果,但術(shù)后的放療、化療及靶向治療,依然是乳腺癌綜合治療的不可缺少的部分,因此探討乳腺癌細(xì)胞耐受化療的機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的化療藥物一直是乳腺癌研究的重要內(nèi)容。臨床試驗(yàn)表明以蛋白酶體為靶點(diǎn)的藥物具有良好的抗腫瘤作用,但是研究顯示腫瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑類(lèi)化療藥物也會(huì)產(chǎn)生耐受治療的現(xiàn)象,而且這與自噬有著密切的關(guān)系。自噬是細(xì)胞內(nèi)由溶酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解過(guò)程,在正常情況下,自噬被限制在基本水平范圍內(nèi),但是在饑餓以及細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化的刺激下,自噬便被激活。雖然研究提示自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有密切的關(guān)系,但以往的研究還很局限,尚未對(duì)其中的機(jī)制進(jìn)行研究,因此我們?cè)谡n題組結(jié)合文獻(xiàn)提出假設(shè):蛋白酶體抑制劑可能部分通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路激活了自噬;抑制與自噬相關(guān)的上游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路能夠增強(qiáng)蛋白酶體抑制對(duì)細(xì)胞的殺傷效果。我們將通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬的作用。方法:本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象,選擇蛋白酶體抑制劑MG-132,自噬抑制劑3-MA和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal為作用藥物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組,MG-132組,MG-132+3-MA組和MG-132+Salubrinal組,通過(guò)MTT法檢測(cè)各組對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的影響,采用免疫蛋白印跡法檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)水平,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Grp-78、GADD153和Caspase-12的表達(dá)水平的檢測(cè),選擇流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)各組對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用的差異,使用RT-PCR法比較各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因Grp-78、GADD153和Caspase-12的m RNA水平,從而研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在MG-132誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞自噬的作用,探討自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在MG-132殺傷MCF-7細(xì)胞中的重要調(diào)控作用。結(jié)果:1MG-132對(duì)MCF-7細(xì)胞具有活性抑制作用,隨著濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)作用增強(qiáng),呈濃度依賴(lài)性與時(shí)間依賴(lài)性,各組濃度抑制作用3小時(shí)開(kāi)始,6小時(shí)開(kāi)始明顯,48小時(shí)最明顯,MG-132濃度為2.5μmol/L作用48小,抑制率為17.4%,當(dāng)濃度為10μmol/L與40μmol/L作用48小時(shí),抑制率分別達(dá)到48.6%與96.3%,通過(guò)SPSS17.0軟件計(jì)算得出MG-132在48小時(shí)的IC20值約為2.5μmol/L,。低濃度3-MA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞沒(méi)有明顯增殖抑制作用,濃度為1mmol/L作用48小時(shí),抑制率為6.1%,3-MA濃度為10mmol/L與20mmol/L作用48小時(shí),抑制率分別達(dá)到46.2%與92.4%,呈濃度依賴(lài)性,計(jì)算得出3-MA在48小時(shí)的IC5值約為1mmol/L。低濃度Salubrinal對(duì)MCF-7細(xì)胞同樣沒(méi)有明顯增殖抑制作用,當(dāng)濃度為5μmol/L與10μmol/L作用48小時(shí),抑制率分別為4.3%與11.5%,當(dāng)Salubrinal濃度為40μmol/L與80μmol/L作用48小時(shí)抑制率分別達(dá)到37.9%與84.8%,呈明顯濃度依賴(lài)性,計(jì)算得出Salubrinal在48小時(shí)的IC5值約為5μmol/L。2蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性檢測(cè)結(jié)果顯示MG-132對(duì)MCF-7細(xì)胞蛋白酶體活性有抑制作用,3h開(kāi)始細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性受抑制,抑制率為65%,48h時(shí)抑制作用最強(qiáng),呈明顯時(shí)間依賴(lài)性。與上述MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比,當(dāng)MG-132作用于MCF-7細(xì)胞3h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)抑制,6h抑制明顯增加,而蛋白酶體活性于3h時(shí)抑制率約為65%,呈現(xiàn)明顯抑制作用,提示先出現(xiàn)蛋白酶體活性的抑制,再出現(xiàn)細(xì)胞增值的抑制。3自噬抑制劑3-MA(1mmol/L)增強(qiáng)MG-132(2.5μmol/L)對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)作用增強(qiáng),48小時(shí)的抑制作用最明顯,呈時(shí)間依賴(lài)性。Salubrinal(5μmol/L)增強(qiáng)MG-132誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞抑制作用,呈時(shí)間依賴(lài)性,作用48小時(shí)后細(xì)胞抑制最明顯,與3-MA相比,其細(xì)胞增殖抑制作用相對(duì)較弱,二者差異48h時(shí)最明顯。4MG-132(2.5μmol/L)能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡與G2期細(xì)胞阻滯,凋亡率為10.6%,G2期細(xì)胞百分比為22.40%。3-MA(1mmol/L)和Salubrinal(5μmol/L)增強(qiáng)MG-132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與G2期細(xì)胞阻滯,凋亡率增加至23.3%和24.7%,G2期細(xì)胞百分比提高至24.80%和25.76%。5MG-132(2.5μmol/L)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞自噬,自噬抑制劑3-MA(1mmol/L)明顯抑制細(xì)胞自噬,阻滯LC3-I至LC3-II的轉(zhuǎn)化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal(5μmol/L)降低LC3-I的表達(dá),抑制LC3-I至LC3-II的轉(zhuǎn)化過(guò)程,顯示自噬抑制作用,但作用弱于3-MA。6與MG-132(2.5μmol/L)組相比,3-MA(1mmol/L)和Salubrinal(5μmol/L)下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3顯示上調(diào),顯示良好的增強(qiáng)MG-132誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡作用。7MG-132(2.5μmol/L)能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal(5μmol/L)能夠有效抑制該過(guò)程,在蛋白與m RNA水平體現(xiàn)抑制作用。與之相似,3-MA(1mmol/L)也表現(xiàn)良好的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制作用,在蛋白與m RNA表達(dá)上具有明顯抑制作用,但作用效果弱于Salubrinal。結(jié)論:蛋白酶體抑制劑MG-132可能部分通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路激活了自噬;抑制與自噬相關(guān)的上游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路能夠增強(qiáng)蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的殺傷作用。
[Abstract]:Objective: Breast cancer is a common malignant tumor, which not only has the characteristics of high recurrence rate, high metastasis rate and high mortality, but also has an increasing incidence year by year. Later radiotherapy, chemotherapy and targeted therapy are still indispensable parts of the comprehensive treatment of breast cancer, so exploring the mechanism of breast cancer cell tolerance to chemotherapy and developing new chemotherapeutic drugs have always been an important part of breast cancer research. Autophagy is a lysosome-mediated process of protein and organelle degradation in cells. Under normal conditions, autophagy is limited to the basic level, but in starvation and in and out of cells. Autophagy is activated under the stimulation of environmental changes. Although studies suggest that autophagy is closely related to endoplasmic reticulum stress, previous studies have been limited and have not yet studied the mechanism of autophagy. Inhibition of autophagy-related upstream endoplasmic reticulum stress signaling pathway enhances the cytotoxicity of proteasome inhibition on breast cancer MCF-7 cells. The preparation MG-132, autophagy inhibitor 3-MA and endoplasmic reticulum stress inhibitor Salubrinal were used as the experimental drugs. The experiment was divided into blank control group, MG-132 group, MG-132+3-MA group and MG-132+Salubrinal group. The effect of each group on the activity of MCF-7 cells was detected by MTT method, and the expression of autophagy-related protein LC3 was detected by Western blot. The levels of Bcl-2, Bax and Caspase-3, and the levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins Grp-78, GADD153 and Caspase-12 were detected. The apoptosis of MCF-7 cells was detected by flow cytometry. The endoplasmic reticulum stress-related genes Grp-78, GAD153 and Caspase-12 were compared by RT-PCR. Results: 1MG-132 inhibited the activity of MCF-7 cells in a concentration-dependent manner with the increase of concentration and prolongation of action time. Sexual and time-dependent, the inhibitory effect of MG-132 concentration was less than that of 2.5 micromol/L, the inhibitory rate was 17.4%. When the concentration of MG-132 was 10 micromol/L and 40 micromol/L for 48 hours, the inhibitory rate reached 48.6% and 96.3%, respectively. The IC20 value of MG-132 at 48 hours was calculated by SPSS17.0 software. The inhibitory rate was 6.1% at 1 mmol/L for 48 hours, 46.2% at 10 mmol/L and 92.4% at 20 mmol/L for 48 hours, respectively. The IC5 value of 3-MA at 48 hours was about 1 mmol/L. Salubrina at low concentration was found to be a concentration-dependent inhibitory effect. When the concentration of Salubrinal was 40 micromol/L and 80 micromol/L for 48 hours, the inhibitory rates were 4.3% and 11.5%, respectively. When the concentration of Salubrinal was 40 micromol/L and 80 micromol/L for 48 hours, the inhibitory rates were 37.9% and 84.8%, respectively. It was found that the IC5 value of Salubrinal at 48 hours was about 5 micron. The results of chymotrypsin-like activity of ol/L.2 proteasome showed that MG-132 could inhibit the activity of proteasome in MCF-7 cells. The activity of proteasome in MCF-7 cells was inhibited by MG-132 at 3 h, the inhibition rate was 65%. The inhibition rate was the strongest at 48 h, which was time-dependent. The inhibition rate of proteasome activity was about 65% at 3 h, suggesting that the inhibition of proteasome activity first appeared, and then the inhibition of cell proliferation. 3-MA (1 mmol/L) enhanced the inhibition of MG-132 (2.5 micromol/L) on cell proliferation, and the inhibition increased with the prolongation of time. Salubrinal (5 micromol/L) enhanced the inhibitory effect of MG-132 on MCF-7 cells in a time-dependent manner. After 48 hours, the inhibitory effect was the most obvious. Compared with 3-MA, the inhibitory effect of Salubrinal (5 micromol/L) on the proliferation of MCF-7 cells was relatively weak, and the difference was the most obvious at 48 hours. 4MG-132 (2.5 micromol/L) could induce MCF-7 cells. 3-MA (1 mmol/L) and Sabrina (5 umol/L) enhanced MG-132-induced apoptosis and G2-phase cell arrest, the apoptosis rate increased to 23.3% and 24.7%, the percentage of G2-phase cells increased to 24.80% and 25.76%. 5 MG-132 (2.5 umol/L) induced autophagy and autophagy inhibition of MCF-7 cells. Preparation 3-MA (1mmol/L) significantly inhibited autophagy and inhibited the transformation of LC3-I to LC3-II. Salubrinal (5umol/L), an endoplasmic reticulum stress inhibitor, decreased the expression of LC3-I and inhibited the transformation of LC3-I to LC3-II, showing autophagy inhibition, but the effect was weaker than that of 3-MA.6, compared with MG-132 (2.5umol/L), and decreased the expression of 3-MA (1mmol/L) and Salubrinal (5umol/L). Anti-apoptotic protein Bcl-2, pro-apoptotic protein Bax and Caspase-3 were up-regulated, indicating a good enhancement of MG-132-induced apoptosis in MCF-7 cells. 7MG-132 (2.5 micromol/L) could induce endoplasmic reticulum stress in MCF-7 cells. Salubrinal (5 micromol/L), an endoplasmic reticulum stress inhibitor, could effectively inhibit this process at protein and m RNA levels. Similarly, 3-MA (1mmol/L) also showed a good inhibitory effect on endoplasmic reticulum stress, and had a significant inhibitory effect on the expression of protein and m RNA, but the effect was weaker than that of Salubrinal. Plasma reticulum stress signaling pathway can enhance the killing effect of proteasome inhibitor MG-132 on breast cancer MCF-7 cells.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2250476