【摘要】：實驗目的：肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最為常見的一種原發(fā)性惡性腫瘤,由于它手術后依然具有較高的復發(fā)性和轉(zhuǎn)移率以及缺乏早期診斷的生物標記,故是最致命的疾病之一。肝細胞肝癌惡性程度較高,全球每年HCC死亡病例數(shù)高達600,000,病死率僅次于肺癌、胃癌居腫瘤相關死亡癌癥的第三位。A20即腫瘤壞死因子a誘導蛋白3,是一種重要的免疫負調(diào)控因子。最初,A20是在腫瘤壞死因子a (TNF-a)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞反應中檢測到的一種誘導性表達蛋白,因此也被稱為TNFAIP3。它于1990年首次作為抗凋亡分子被鑒定出來。人類A20基因定位于6號染色體長臂第23位,其cDNA序列為4000bp,開放閱讀框為2370bp,編碼790氨基酸的90kDa蛋白。A20的氨基酸序列具有高度保守性,通過電鏡結(jié)構(gòu)我們發(fā)現(xiàn)其N端具有卵巢腫瘤(OTU)結(jié)構(gòu)域,其晶體結(jié)構(gòu)顯示含有10個b-螺旋和10個a-螺旋,此部位是泛素結(jié)合部位,具有去泛素化蛋白酶活性作用；而其C端則具有7個連續(xù)的Cys2-Cys2鋅指結(jié)構(gòu)域,具有泛素連接酶活性。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是一個多步驟,多因素的復雜過程,首先是腫瘤組織內(nèi)生成新生血管,然后腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落,尋找時機侵入周圍基底膜和細胞外基質(zhì),從而使其進入血管和淋巴管中,隨著血液循環(huán),腫瘤細胞可到達身體各器官和組織,在某一處腫瘤細胞從血管和淋巴管中穿出進入相應的靶器官然后增殖生長成為新的轉(zhuǎn)移灶。在這一系列的復雜過程中,有一些分子發(fā)揮著重要作用,比如細胞粘附分子,如鈣黏蛋白家族分子、整合素分子；大量文獻表明,鈣黏蛋白家族分子(E-cadherin, N-cadherin)主要介導細胞與細胞之間的相互作用,其表達的變化與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。整合素分子主要介導細胞與細胞外基質(zhì)問的相互作用,同時也介導細胞間的相互作用。大量文獻表明TNF-α可通過PI3K/Akt通路；NF-κB信號通路；STAT3信號通路等多條通路來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的EMT現(xiàn)象從而增強腫瘤細胞的運動能力；同時A20是典型的NF-κB信號通路抑制劑,它通過其雙功能泛素編輯酶的作用可以抑制TNF-α所激活的NF-κB信號通路。因此我們初步假設A20可否抑制TNFa增強的腫瘤細胞的運動能力。由于肝癌具有較高的復發(fā)性和轉(zhuǎn)移率,惡性程度較高難以治愈,是世界范圍研究的熱點。所以我們把關注點集中在肝癌細胞上。首先我們選取75例肝癌病人的組織切片,分別取其癌組織和癌旁組織,運用免疫組化技術檢測A20在癌和癌旁的表達區(qū)別,實驗結(jié)果提示我們A20可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。由于我們目標在A20和肝癌轉(zhuǎn)移方面的聯(lián)系,隨后我們又選取106例肝癌病人的癌組織切片,采用免疫組化雙染技術,檢測A20和CD34,選出可以觀察到腫瘤細胞微血管侵犯的片子,然后對選出的片子進行統(tǒng)計,分析侵入微血管和未侵入血管的腫瘤細胞其A20的表達的差異。隨后我們進行體外實驗,對多種肝癌細胞進行檢測A20的表達情況,確定高表達和低表達細胞系。選取A20低表達細胞系SMMC-7721和huh-7,設計四組,分別為轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pRK5組,轉(zhuǎn)染A20組,轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pRK5組,轉(zhuǎn)染A20組。前兩組為對照不做處理,后兩組在轉(zhuǎn)染24h后加入TNFa刺激,作用濃度為50ng/ml,作用時間為24h。隨后對其進行細胞遷移和侵襲實驗,觀察A20能否抑制腫瘤細胞的運動能力。然后研究其機制,主要分為兩方面：其一,A20能否抑制TNF誘導的肝癌細胞的EMT進程,選用兩種標志物上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)和神經(jīng)型鈣粘蛋白(N-cadherin)。其二,A20能否抑制TNF誘導的肝癌細胞的FAK的活化,選用兩個磷酸化位點pFAK(397),pFAK(861)。從蛋白水平來檢測其活化狀態(tài)。再選取A20高表達細胞系Hep3B,對其進行siRNA干擾,也是分成四組,處理方法和過表達體系一致。隨后檢測相關指標。最后,我們進行體內(nèi)實驗,選用高轉(zhuǎn)移肝癌細胞系HCCLM3,皮下接種裸鼠并注射TNFa和A20表達質(zhì)粒,一段時間后處死小鼠,制備腫瘤組織切片用免疫組化檢測CD34,觀察腫瘤細胞的微血管侵犯。通過一系列實驗我們可以初步證明A20可抑制TNFa增強的腫瘤細胞的運動能力,并且是通過影響EMT和FAK來實現(xiàn)的。實驗方法：一、采用肝癌臨床標本檢測A20的表達與肝癌轉(zhuǎn)移的相關性。1、A,20與肝癌的發(fā)生發(fā)展間的相關性(1)肝癌病人組織芯片此次實驗所使用的肝癌病人組織芯片為75例病人的臨床標本包括其肝癌組織和癌旁組織,并附有病人的詳細資料。(2)采用免疫組織化學方法檢測組織芯片中A20在癌組織和癌旁組織的表達差異。采用免疫組化技術檢測肝癌組織芯片中A20的表達情況。此芯片經(jīng)過3小時75度烘烤后進行脫蠟與水化,此一抗為A20 (abeam兔抗人單克隆抗體,1：500稀釋,)。次日加入二抗(中杉金橋,山羊抗兔),用DAB染色劑進行染色,并用蘇木素染液染其細胞核,最后氨水返藍,封片保存。2、A,20和肝癌的運動性的相關性(1)肝癌病人組織芯片此次實驗使用106例肝癌病人組織切片均來自于齊魯醫(yī)院包括,并附有病人的詳細資料。(2)采用免疫組化雙染方法檢測中浸入血管中腫瘤細胞A20的表達與血管外的差異運用免疫組化雙染試劑盒(購于中杉金橋公司)分別標記A20和CD34,其中A20購于abeam公司,為兔抗人單克隆抗體,1：400稀釋使用；CD34購于中杉金橋公司,為鼠抗人單克隆抗體,1：60稀釋使用。二抗分別為山羊抗兔和山羊抗鼠,其中A20被染成棕色,CD34被染成紅色。其于步驟一致。(3)采用免疫組化雙染方法鑒定中浸入血管中的是否是腫瘤細胞仍然使用免疫組化雙染試劑盒(購于中杉金橋公司)分別標記CK8/18和CD34,其中CK8/18購于中杉金橋公司,為鼠抗人單克隆抗體,1：100稀釋使用；CD34購于abcam公司,為兔抗人單克隆抗體,1：350稀釋使用。二抗分別為山羊抗兔和山羊抗鼠,其中CK8/18被染成棕色,CD34被染成紅色。其于步驟一致。二、選擇確定及培養(yǎng)A20高表達細胞株和低表達細胞株選擇肝癌細胞系為SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、Hep-3B、HepG2、 HCCLM3,經(jīng)過蛋白水平檢測確定A20高表達細胞株和低表達細胞株。其中肝癌細胞系SMMC-7721、HEL-7402和HepG2均購于中國科學院上海細胞庫,使用RPMI 1640培養(yǎng)基加入青霉素氯霉素雙抗及10%FBS,于370C、5%CO2孵箱中培養(yǎng)；huh-7購于中國科學院上海細胞庫,使用DMEM培養(yǎng)基加入青霉素氯霉素雙抗及10%FBS培養(yǎng)；Hep-3B購于中國科學院上海細胞庫,使用MEM培養(yǎng)基加入青霉素氯霉素雙抗及10%FBS培養(yǎng)；HCCLM3購于武漢細胞庫,使用DMEM培養(yǎng)基加入青霉素氯霉素雙抗及10%FBS培養(yǎng)三、A20對肝癌細胞系運動能力的作用及其機制研究1、發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象--運用細胞遷移實驗檢測A20影響TNF-a誘導的肝癌細胞運動能力選擇A20低表達細胞株SMMC-7721和huh-7,對其轉(zhuǎn)染A20質(zhì)粒使其過表達,隨后對其進行細胞遷移和侵襲實驗,觀察A20能否抑制腫瘤細胞的運動能力。再選取A20高表達細胞系Hep3B,對其shRNA干擾,處理方法和過表達體系一致。隨后檢測相關指標。2、尋找機制-從蛋白和RNA水平檢測相關通路的變化(1)A20影響TNF-a誘導的肝癌細胞EMT改變a)采用PCR和Western-blot檢測A20對EMT相關分子作用情況仍然采用A20過表達體系和干擾體系,分組和處理方式與上述一致。選用EMT相關指標上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)和神經(jīng)型鈣粘蛋白(N-cadherin)。分別從RNA和蛋白水平檢測A20的作用。b)進一步證明A20是通過NF-κB信號通路來作用于EMT相關分子選用細胞系及分組處理方法與上述一致,此次使用共轉(zhuǎn)染的方法,用脂質(zhì)體包裹P65小干擾和A20質(zhì)�；駻20小干擾shRNA一同轉(zhuǎn)入細胞系中。其共轉(zhuǎn)染體系分組為A20高表達體系：PRK5+siNC, A20+siNC, PRK5+siP65, A20+siP65;A20低表達體系：shNC+siNC, shA20+siNC, shNC+siP65, shA20+siP65。之后再收取蛋白,用Western-blot方法檢測A20是否通過NF-κB信號通路來作用于EMT相關分子。(2)A20影響TNF-a誘導的肝癌細胞FAK的活性a)采用Western-blot技術檢測A20對FAK的作用選用相應的A20高表達細胞株和低表達細胞株對其進行過表達和小干擾。分組和處理方式與上述一致。對于研究對象黏著般激酶FAK,選用兩個磷酸化位點pFAK(397),pFAK(861)。從蛋白水平來檢測A20對其作用。b)證明A20是通過結(jié)合RIPK1來對FAK發(fā)揮作用首先選用肝癌細胞SMMC-7721,接種到6孔板中,待其貼壁后使用脂質(zhì)體包裹RIPK1小干擾進入細胞中,采用Western-blot檢測RIPK1的干擾效率。繼續(xù)選用SMMC-7721將其按一定數(shù)目接種到6孔板中,此次實驗分三組,空白對照,只加入TNFa組,加入TNFa及RIPK1干擾組。采用Western-blot方法來驗證在TNFa刺激下當RIPK1被干擾后,FAK的磷酸化水平是否降低。隨后,我們證明A20是否可以通過作用于RIPK1來影響FAK的磷酸化。仍然選用SMMC-7721細胞系,按上述方法接種到6孔細胞培養(yǎng)板中,次日待其貼壁后進行共轉(zhuǎn)染,使用脂質(zhì)體LIP2000包裹RIPK1小干擾和A20質(zhì)粒共同進入細胞中,24小時后加入TNFa刺激,一段時間后收取蛋白,采用Western-blot方法來驗證A20是否可以通過作用于RIPK1來影響FAK的磷酸化。此次實驗分為四組,均加入TNFa刺激分別為：PRK5+siNC, A20+siNC, PRK5+siRIPK1, A20+ siRIPK1。c)A20是通過作用FAK來影響RAC1活性選用相應的AA20高表達細胞株Hep-3B和低表達細胞株SMMC-7721, huh-7對其進行過表達和小干擾。分組和處理方式與上述一致。將細胞消化后種于直徑10cm培養(yǎng)皿中,貼壁后轉(zhuǎn)染A20,加刺激,然后按RAC1活性試劑盒方法收取蛋白檢測其活性。四、體內(nèi)實驗驗證A20對肝癌細胞運動性的作用(1)裸鼠腫瘤模型的構(gòu)建購買裸鼠10只,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,周齡4-6周,雄性。準備肝癌細胞系HCCLM3,培養(yǎng)傳代,狀態(tài)良好后將其腋下注射打人裸鼠皮下,細胞數(shù)為每只1×107個,兩周后腫瘤形成,分為兩組,開始分別注射空白質(zhì)粒pRK5和A20質(zhì)粒兩天一次。同時注射TNF α。質(zhì)粒注射5次后處死裸鼠,取出腫瘤塊,石蠟包埋切片。(2)免疫組織化學技術檢測腫瘤細胞的微血管侵犯此次腫瘤標本共10例,對照組和實驗組各5例；對照組為空白質(zhì)粒pRK5注射組和實驗組為重組質(zhì)粒pRK5-A20注射組,采用免疫組化技術檢測腫瘤標本中CD34的表達情況。此石蠟切片經(jīng)過2小時75度烘烤后進行脫蠟,水化,高溫高壓熱修復,冷卻后在進行阻斷其內(nèi)源性過氧化物酶,PBS清洗用山羊血清封閉其非特異性位點,室溫40分鐘后加入一抗4℃過夜。此一抗為CD34 (abcam鼠抗兔單克隆抗體,1：200稀釋)。次日加入二抗(中杉金橋,山羊抗鼠),用DAB染色劑進行染色,并用蘇木素染液染其細胞核,最后氨水返藍,封片保存。實驗結(jié)果：一A20與肝癌的轉(zhuǎn)移具有相關性在肝癌病人組織芯片中,75例病人的肝癌組織和癌旁組織檢測A20的表達差異,選擇相應視野通過統(tǒng)計分析得出A20在癌旁組織中的表達顯著高于其在肝癌組織中的表達(P0.001)。我們探究A20能否抑制肝癌的轉(zhuǎn)移,選用106例肝癌病人組織切片進行免疫組化雙染,目的蛋白為A20和血管內(nèi)皮CD34,其中A20被染成棕色,CD34被染成紅色。其中有89例肝癌病人組織切片可以觀察到腫瘤細胞的微血管侵犯。統(tǒng)計分析可以得出進入到血管中的腫瘤細胞其A20的表達顯著低于未侵入血管中的腫瘤細胞A20的表達(P0.001)。這提示A20可能對肝癌細胞的轉(zhuǎn)移起到抑制作用。為了進一步確定侵入血管中的是腫瘤細胞而不是其他間質(zhì)細胞,我們采用組化雙染,靶蛋白為CD34和角蛋白CK8/18,其中CK8/18蛋白染成棕色,CD34被染成紅色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)侵入血管中的細胞可表達角蛋白CK8/18,這表明侵入血管中的細胞是腫瘤細胞。二肝癌細胞系中A20表達差異的鑒定我們選用五種肝癌細胞系SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、Hep-3B、HCCLM3通過蛋白水平檢測Hep-3B為A20高表達細胞株,SMMC-7721、HEL-7402、huh-7、 HCCLM3為A20低表達細胞株。因此在體外實驗過程中我們選用SMMC-7721、 huh-7構(gòu)建A20過表達體系,選用Hep-3B進行A20干擾使其低表達。在體內(nèi)實驗時選用肝癌細胞高轉(zhuǎn)移細胞系HCCLM3構(gòu)建腫瘤模型。三A20能夠抑制TNF a誘導的肝癌細胞的侵襲和遷移體外實驗驗證A20對肝癌侵襲和遷移實驗的研究采用細胞跨膜的方法即transwell小室來實施：結(jié)果顯示在TNFa刺激下,當高表達A20時,A20能夠抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力：當干擾A20表達后,干擾組的肝癌細胞其遷移和侵襲能力則會增強。然而,在未刺激組無論A20表達高低與否,其對肝癌細胞的運動能力沒有作用。因此我們認為A20可抑制由TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。四A20主要通過影響EMT進程和FAK的活化來抑制肝癌細胞的運動能力對其機制研究發(fā)現(xiàn)：首先A20是典型的NF-κB抑制劑,它能抑制TNFa引起的NF-κB的活化。隨后通過查閱文獻我們猜想：A20可能通過影響肝癌細胞的EMT進程和FAK-RAC1通路來抑制TNFα誘導的肝癌細胞的侵襲和遷移。我們選取A20過表達和低表達兩種細胞體系來驗證猜想。首先,實驗發(fā)現(xiàn)A20能抑制TNFa誘導的肝癌細胞的EMT進程,即在蛋白水平和RNA水平均能上調(diào)E-cad,下調(diào)N-cad。隨后,我們阻斷NF-κB通路,發(fā)現(xiàn)A20抑制EMT相關分子的現(xiàn)象消失了。說明A20通過阻斷NF-κB通路來抑制TNFa誘導的肝癌細胞EMT進程。其次,實驗發(fā)現(xiàn)A20可以降低TNFa誘導的FAK的磷酸化水平,同時降低了FAK下游的RAC1-GTP活性。我們還發(fā)現(xiàn)當沉默RIPK1表達后A20對TNFa誘導的FAK活化的抑制作用明顯減弱了,這表明A20可能通過對RIPK1的泛素化降解,影響RIPK1和FAK的結(jié)合,進而抑制FAK的活化。而在未刺激組中無論A20表達高低與否,其對EMT分子和FAK、RAC1的表達均無明顯作用。綜上所述,我們認為A20可通過抑制TNFa引起的NF-κB的活化來阻礙肝癌細胞的EMT進程,還可以通過RIPK1來阻斷FAK-RAC1通路的活化,從而最終抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。五體內(nèi)實驗驗證A20對肝癌運動能力的作用在體外細胞實驗已證明A20可以通過作用于EMT和FAK抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力,因此我們通過裸鼠皮下成瘤實驗來進一步驗證A20的功能。實驗結(jié)果顯示,與對照組(注射空白載體pRK5)相比,實驗組(注射pRK5-A20質(zhì)粒)腫瘤細胞微血管侵犯的數(shù)量顯著減少。這表明A20對肝癌運動能力的抑制作用。實驗結(jié)論：一A20抑制由TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。二A20通過影響EMT進程來抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。三A20通過作用RIPK1/FAK/RAC通路來抑制TNFa誘導的肝癌細胞的運動能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2224753