【摘要】：研究目的：正常造血干祖細(xì)胞向白血病細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是由多種因素的改變所引起的,包括基因改變等細(xì)胞內(nèi)在的因素及微環(huán)境作用異常等細(xì)胞外部的因素。造血干祖細(xì)胞與骨髓微環(huán)境之間相互作用的改變,與白血病的發(fā)生密切相關(guān)。Rac1作為造血干細(xì)胞歸巢的關(guān)鍵調(diào)控分子,參與造血細(xì)胞與骨髓微環(huán)境的相互作用,在多種類型的白血病細(xì)胞中存在Rac1 GTPase的高度活化。本研究通過探索Rac1 GTPase的高度活化對造血干祖細(xì)胞生物學(xué)行為及其對骨髓微環(huán)境與造血干祖細(xì)胞之間相互作用的影響,最終闡明Rac1 GTPase的高度活化所引起的骨髓微環(huán)境和造血干細(xì)胞相互作用異常在造血干祖細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及白血病發(fā)展和維持中的作用。研究方法：構(gòu)建表達(dá)組成活化型Rac1、AML1-ET09a (AE9a)單基因及共表達(dá)組成活化型Rac1、AML1-ET09a (AER)雙基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,包裝病毒,感染經(jīng)免疫磁珠富集后的C-kit+小鼠造血干祖細(xì)胞。用、Veseren blot和Pull down的方法檢測蛋白表達(dá)水平,通過Transwell方法檢測感染后GFP陽性細(xì)胞的遷移能力,與Fibronectin勺粘附實驗檢測粘附能力,培養(yǎng)于甲基纖維素中檢測集落形成能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測GO期比例,qRT-PCR檢測微環(huán)境相關(guān)分子的表達(dá)水平。用含AE9a單基因或AER雙基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染造血干祖細(xì)胞并移植受體鼠,構(gòu)建小鼠白血病發(fā)病模型。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)病小鼠的免疫表型,瑞氏染色和HE染色觀察發(fā)病小鼠的病理類型。將AE9a組和AER組發(fā)病小鼠的脾臟細(xì)胞移植半致死劑量照射后的受體小鼠,流式細(xì)胞術(shù)檢測18h細(xì)胞歸巢能力,以及不同時間點GFP陽性細(xì)胞在骨髓、脾臟中的分布,并觀察兩組小鼠的生存期。在Rac1抑制劑處理實驗中,AER組發(fā)病小鼠細(xì)胞體外經(jīng)Rac1抑制劑EHT1864孵育2h后移植照射后受體小鼠,觀察歸巢能力、白血病細(xì)胞隨時間變化的分布及生存期。用膠原酶消化新生鼠顱骨的方法獲取成骨細(xì)胞,用小鼠骨髓細(xì)胞體外貼壁培養(yǎng)的方法獲取基質(zhì)細(xì)胞,將獲取的細(xì)胞與AER組小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)4d后,檢測細(xì)胞周期,凋亡,集落形成能力的變化。在體內(nèi)藥物處理實驗中,AER組小鼠細(xì)胞移植受體鼠后隨機分為4組,按如下時間和劑量經(jīng)過腹腔注射給藥：(1)PBS(第5-9天), (2) Ara-C (500 mg/kg.d,第8,9 天), (3) EHT1864 (40 mg/kg.d,第5-9天), (4) Ara-C (500 mg/kg.d,第8,9天) and EHT1864 (40 mg/kg.d,第5-9天),觀察小鼠的生存期及不同天數(shù)尾血血象及GFP陽性細(xì)胞變化。研究結(jié)果：成功構(gòu)建三種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,蛋白表達(dá)檢測顯示感染后的骨髓細(xì)胞中活化型Rac1 GTPase表達(dá)升高,有AE9a的表達(dá)。表達(dá)組成活化型Rac1的小鼠c-Kit+造血干祖細(xì)胞遷移能力增強,粘附能力增強,集落形成能力增強,GO期比例上升,微環(huán)境相關(guān)分子的表達(dá)水平升高,與對照組相比都具有顯著差異。成功建立單基因AE9a和雙基因AER小鼠發(fā)病模型,發(fā)病小鼠細(xì)胞基因組中有AE9a和活化型Rac1 GTPase的整合,二者蛋白水平升高,組織病理檢測顯示骨髓、脾臟、肝臟瘤細(xì)胞浸潤,瑞氏染色外周血、骨髓、脾臟中幼稚細(xì)胞增多,免疫表型顯示為急性髓系白血病。與AE9a組發(fā)病小鼠細(xì)胞相比,AER組發(fā)病小鼠細(xì)胞二次移植受體鼠后的生存期縮短,移植后不同天數(shù)GFP陽性細(xì)胞在外周血和骨髓的比例增多,細(xì)胞歸巢能力增強,與歸巢相關(guān)的分子表達(dá)水平升高,兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在Rac1抑制劑處理實驗中,AER組發(fā)病小鼠細(xì)胞體外經(jīng)EHT1864孵育2h后移植小鼠,生存期較對照組顯著延長,移植后不同天數(shù)GFP陽性細(xì)胞在骨髓和脾臟的比例降低,處理后的細(xì)胞歸巢能力顯著降低,與歸巢相關(guān)的分子表達(dá)水平降低。AER組發(fā)病小鼠骨髓細(xì)胞分別與骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞共培養(yǎng),共培養(yǎng)組骨髓細(xì)胞的GO期比例顯著增多。與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后的骨髓細(xì)胞凋亡水平降低,集落形成能力增強。與MSC共培養(yǎng)后,可以使更多的白血病細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。在體內(nèi)藥物處理實驗中,相比對照組,EHT1864組小鼠在不同天數(shù),外周血GFP陽性率及白細(xì)胞數(shù)目無顯著差異。而相比Ara-C組,兩種藥物聯(lián)合組小鼠在不同天數(shù)外周血GFP陽性率及白細(xì)胞數(shù)目均顯著降低,小鼠生存期顯著延長。研究結(jié)論：Rac1 GTPase的高度活化能夠增強造血干祖細(xì)胞的遷移、粘附能力,促進(jìn)造血干祖細(xì)胞的集落形成能力和靜息水平,這些生物學(xué)行為的變化促進(jìn)造血干祖細(xì)胞與骨髓微環(huán)境之間的相互作用。Racl GTPase的高度活化通過促進(jìn)白血病細(xì)胞歸巢到骨髓微環(huán)境并改變與微環(huán)境的相互作用,從而促進(jìn)白血病細(xì)胞維持靜息和抵抗凋亡的能力,進(jìn)而加速白血病的發(fā)病進(jìn)程。通過靶向R ac1 GTPase高度活化的抑制劑EHT1864聯(lián)合化療藥物可以有效延長發(fā)病小鼠的生存期。研究目的:A20亦稱為TOF-a誘導(dǎo)的蛋白3(TNFAIP3),是調(diào)節(jié)細(xì)胞生存的重要分子,在多種惡性腫瘤的發(fā)生中有重要作巧。A20在多種卿瘤如乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等中都存在異常的過表達(dá)。雖然A20在淋己瘤中抑癌基因的作用己被證實,但是目前關(guān)于A20在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能尚不明確。本研究通過檢測A20在ALL細(xì)胞中的表達(dá)及下調(diào)A20表達(dá)W探索A20蛋白在ALL中的生物學(xué)功能及相關(guān)分子機制。研究方法:用WB檢測ALL病人標(biāo)本及幾種ALL細(xì)胞系中A20的表達(dá)。構(gòu)建含有A20-shRNA的慢病毒載體,感染ALL細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞、Nalm-6領(lǐng)胞和Reh細(xì)胞,用qRT-PC民巧WB檢測A20干擾效果。MTT的方法檢測感染后的細(xì)胞X椫襯芰岸曰埔┑腎C50,用PI楊記檢測周期變化,用Annexin V聯(lián)合PI的方法檢測細(xì)胞調(diào)亡水平及對化療藥物的敏感性。裸鼠成瘤實驗檢測細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。WB檢測細(xì)胞增遣、周期、調(diào)亡等相關(guān)信號分子的表達(dá)變化。研究結(jié)果:相對正常供者,在ALL病人骨髓單個核細(xì)胞及ALL細(xì)胞系中A20蛋白表達(dá)水顯著增加。成功構(gòu)建含有A20-shRNA的慢病毒載體,并且經(jīng)過qRT-PCR和WB實驗證實干擾效果明顯;功能實驗顯示,相比對照組,在Jurkat細(xì)胞、Nalm-6細(xì)胞和Reh細(xì)胞中下調(diào)A20表達(dá)后,細(xì)胞增殖減慢,X椫誠喙匭藕歐腫覧RK碳酸化水平顯著減低;細(xì)胞周期的G0/G1期比例增加,S期比例減低,周期相關(guān)信號分子p21和p53表達(dá)水平升高。Nalm-6細(xì)胞的裸鼠成瘤能力在干化A20后顯著降低;在Jurkat細(xì)胞和R濁細(xì)胞中,降低A20表達(dá)可明顯促進(jìn)細(xì)胞潤亡,且調(diào)亡相關(guān)分子BCX-2表達(dá)下調(diào)。H種細(xì)胞在下調(diào)A20表達(dá)后對化療藥物柔紅霉素的敏感性增加。研究結(jié)論:本研究表明A20在ALL中高表達(dá),降低A20表達(dá)可W降低細(xì)胞的增殖能力,且抑制增殖相關(guān)的信號通路的活化,將更多的細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G0/G1期,更少的細(xì)胞進(jìn)入S期。降低A20表達(dá)可則月顯促進(jìn)細(xì)胞的調(diào)亡。在柔紅霉素的化療中,降低A20的表達(dá)可以增強細(xì)胞對化療藥物柔}霉素的敏感性。本研究提示A20在ALL細(xì)胞中起到抗調(diào)亡,促進(jìn)細(xì)胞X椫車淖饔，

本文編號：2220872