【摘要】：背景:研究人員利用軟件分析得出在人類染色體17q12-q23區(qū)域內(nèi)約編碼693個基因,其中在BRCA1基因上游存在一個大小約為6.3MB的基因,稱為配子生成素結(jié)合蛋白(gametogenetin binding protein 2,GGNBP2)�，F(xiàn)階段對于GGNBP2在惡性腫瘤中所發(fā)揮的作用以及其潛在的作用機制的研究仍處于起步階段。本課題組擬通過臨床病例資料、體內(nèi)、體外實驗等不同層面研究闡明GGNBP2在乳腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移中的作用和機制,了解GGNBP2基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能,為乳腺癌的治療研究提供新的靶點。方法:1.利用多組織陣列分析的方法分別檢測人九種正常組織中GGNBP2的差異表達情況,同時比較正常乳腺腺體和乳腺癌組織中GGNBP2不同表達情況,且比較了轉(zhuǎn)移灶與未轉(zhuǎn)移灶乳腺癌組織中GGNBP2的表達情況。2.利用RT-PCR實驗檢測Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠中正常乳腺組織和乳腺癌組織標本中GGNBP2的差異表達情況。3.在不同ERα狀態(tài)細胞中,構(gòu)建過表達GGNBP2細胞系,繪制細胞的生長曲線,并利用雌二醇刺激不同GGNBP2水平細胞,檢測其對雌二醇刺激的敏感性;并利用三維培養(yǎng),比較母代T47D細胞和T47D-GGNBP2細胞的細胞團形態(tài)和數(shù)量改變。4.采用劃痕實驗、Transwell實驗、軟瓊脂克隆實驗,分別檢測T47D-His C細胞和T47D-GGNBP2細胞的不同移動能力、侵襲能力以及體外成瘤能力,觀察過表達GGNBP2對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響。5.利用多組氨酸Pull-down實驗檢測ERα、ERβ與GGNBP2蛋白相互結(jié)合的情況,并利用雌二醇進行刺激比較其共沉淀的改變。6.將GGNBP2過表達載體(pc DNA3-GGNBP2)或者空載體(pcDNA3-His C)和雌激素反應(yīng)單元(ERE)的熒光素酶表達載體共轉(zhuǎn)染入T47D細胞,并進行熒光素酶報告基因檢測。利用Western blot實驗檢測在T47D-His C細胞和T47D-GGNBP2細胞中CCND1和TFF1蛋白的不同表達情況。7.構(gòu)建過表達T47D-GGNBP2細胞的體內(nèi)移植瘤模型,檢測改變GGNBP2表達后對乳腺癌體內(nèi)的生物學(xué)行為的影響。同時利用RT-PCR檢測移植瘤中GGNBP2的m RNA轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果:1.多組織表達陣列分析發(fā)現(xiàn)在乳腺、卵巢、子宮、胃、腎、結(jié)腸、直腸、甲狀腺及前列腺癌等九種組織中,GGNBP2均有基礎(chǔ)表達,其中在乳腺組織中的表達量最高,在腎臟組織中表達最低。利用探針陣列分析了50對人體正常乳腺腺體和乳腺腫瘤組織的配對組織中GGNBP2的表達情況,發(fā)現(xiàn):乳腺癌組織GGNBP2的表達水平明顯降低,且在同一患者的轉(zhuǎn)移灶組織中,GGNBP2的表達也有所下調(diào)。2.在Wnt1轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)產(chǎn)生的乳腺腫瘤組織中,GGNBP2的m RNA水平較正常組織有了顯著的降低。3.在人乳腺癌細胞系或者正常乳腺細胞系T47D、MCF-7、MCF-10A和MCF-10F中,構(gòu)建穩(wěn)定過表達GGNBP2的細胞系。培養(yǎng)了4天后,相較于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞系,僅在ERα陽性的T47D和MCF-7中GGNBP2過表達的細胞系的細胞數(shù)量顯著降低。4.穩(wěn)定過表達外源性GGNBP2的T47D細胞系的增殖較對照組(T47D-His C組)顯著降低。而且發(fā)現(xiàn)相較于T47D-His C細胞,T47D-GGNBP2 clone15細胞對雌二醇的刺激不敏感。三維培養(yǎng)空間發(fā)現(xiàn)T47D-GGNBP2細胞的細胞團較小且數(shù)量顯著降低。5.劃痕和Transwell實驗顯示,相較于母代T47D和T47D-His C細胞,T47D-GGNBP2細胞的遷移和侵襲能力下降;軟瓊脂克隆檢測發(fā)現(xiàn):T47D-GGNBP2細胞克隆形成能力顯著下調(diào)。6.組氨酸Pull-down實驗檢測發(fā)現(xiàn),僅ERα可與His標記的GGNBP2共沉淀,而ERβ與GGNBP2無關(guān),且1μM雌二醇刺激下更多的ERα同GGNBP2共沉淀。7.熒光素酶報告基因結(jié)果表明,在T47D-His C細胞中,雌二醇可激活ERE的轉(zhuǎn)錄活性。然而在T47D-GGNBP2細胞中,雌二醇誘導(dǎo)ERE的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低8.構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,對體內(nèi)移植瘤體積進行檢測發(fā)現(xiàn):相較于母代T47D的移植瘤,T47D-GGNBP2體外移植瘤的增長能力顯著下降。結(jié)論:1.臨床數(shù)據(jù)及小鼠實驗結(jié)果顯示:GGNBP2在正常乳腺組織存在表達,且在乳腺癌組織中GGNBP2表達下調(diào),說明GGNBP2與乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。2.GGNBP2在乳腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用,影響ERα陽性乳腺癌體內(nèi)、體外的生長增殖能力,并抑制ERα陽性乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.GGNBP2可作為ERα的共阻抑蛋白來調(diào)控其靶基因CCND1和TFF1的表達或者活性,最終調(diào)控乳腺癌細胞增殖。
[Abstract]:BACKGROUND: Researchers used software to analyze 693 genes encoded in the 17q12-q23 region of human chromosome, including a 6.3 MB gene called gametogenetin binding protein 2 (GGNBP2) upstream of BRCA1 gene. Our Research Group intends to elucidate the role and mechanism of GGNBP2 in the proliferation and metastasis of breast cancer cells through clinical data, in vivo and in vitro experiments, and to understand the function of GGNBP2 gene in the development of breast cancer. Target: Methods: 1. Differential expression of GGNBP2 in nine normal human tissues was detected by multi-tissue array analysis, and the expression of GGNBP2 in normal breast and breast cancer tissues was compared. The expression of GGNBP2 in metastatic breast cancer and non-metastatic breast cancer tissues was compared. 2. Wnt1 was detected by RT-PCR assay. Differential expression of GGNBP2 in normal breast tissues and breast cancer tissues of transgenic mice. 3. Overexpression of GGNBP2 was constructed in different ERalpha state cells, and cell growth curves were drawn. Estradiol was used to stimulate cells with different GGNBP2 levels to detect their sensitivity to estradiol stimulation. Morphological and quantitative changes of maternal T47D cells and T47D-GGNBP2 cells. 4. Scratch test, Transwell test and soft agar cloning test were used to detect the different mobility, invasiveness and tumorigenicity of T47D-His C cells and T47D-GNBP2 cells, respectively. The effects of overexpression of GGNBP2 on the biological behavior of breast cancer cells were observed. 5. Polyhistidine Pull-down assay was used to detect the binding of ERa, ERbeta and GGNBP2 protein, and estradiol was used to stimulate and compare the changes of co-precipitation. 6. Luciferase expression vectors of GGNBP2 overexpression vector (pc DNA 3-GNBP2) or empty vector (pcDNA3-His C) and estrogen response unit (ERE) were co-transfected into T47D cells. The expression of CCND1 and TFF1 proteins in T47D-His C cells and T47D-GGNBP2 cells was detected by Western blot. 7. An in vivo transplanted tumor model was established to detect the effect of GGNBP2 expression on the biological behavior of breast cancer. The expression of GGNBP2 was detected in breast, ovary, uterus, stomach, kidney, colon, rectum, thyroid and prostate cancer. The expression of GGNBP2 was the highest in breast tissue and the lowest in kidney tissue. The expression of GGNBP 2 in 50 paired tissues of human normal breast gland and breast tumor was studied. It was found that the expression of GGNBP 2 in breast cancer was significantly decreased, and the expression of GGNBP 2 was also down-regulated in the metastatic tissues of the same patient. 2. In the spontaneously generated breast tumor tissues of Wnt1 transgenic mice, the expression of GGNBP 2 in M RNA water was observed. In human breast cancer cell lines or normal breast cell lines T47D, MCF-7, MCF-10A and MCF-10F, stable GGNBP2 overexpression cell lines were constructed. After 4 days of culture, compared with empty plasmid transfected breast cancer cell lines, only ER-positive T47D and MCF-7 GGNBP2 overexpression cell lines were constructed. The proliferation of T47D cells stably overexpressing exogenous GGNBP2 was significantly lower than that of the control group (T47D-His C group). Compared with T47D-His C cells, T47D-GGNBP2 clone 15 cells were not sensitive to estradiol stimulation. The cell mass of T47D-GGNBP2 cells was smaller and the number of T47D-GNBP2 cells was significantly lower in three-dimensional culture space. Compared with T47D and T47D-His C cells, the migration and invasion of T47D-GGNBP2 cells were decreased, and the cloning ability of T47D-GGNBP2 cells was significantly down-regulated by soft agar cloning assay. 6. Histidine Pull-down assay showed that only ERa could co-precipitate with His-labeled GGGGNBP2, but ERbeta was not related to GGNBP2, and 1 mu was found. The results of luciferase reporter gene showed that estradiol could activate the transcriptional activity of ERE in T47D-His C cells. However, in T47D-GGNBP2 cells, the transcriptional activity of ERE induced by estradiol decreased significantly 8. The nude mice transplanted tumor model was constructed and the tumor volume in vivo was detected. Compared with maternal T47D transplanted tumor, the growth ability of T47D-GGNBP2 in vitro transplanted tumor decreased significantly. Conclusion: 1. Clinical data and mouse experimental results showed that GGNBP2 was expressed in normal breast tissue, and GGNBP2 was down-regulated in breast cancer tissue, indicating that GGNBP2 is closely related to the occurrence and development of breast cancer. 2. GGGNBP2 can be found in breast cancer. GGNBP2 can act as a co-inhibitory protein of ER-alpha to regulate the expression or activity of its target genes CCND1 and TFF1, and ultimately regulate the proliferation of breast cancer cells.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2215422