【摘要】：第一部分EPAS1通過EGFR和MET信號通路調(diào)控非小細胞肺癌TKI耐藥性目的:肺癌已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位的惡性腫瘤。非小細胞肺癌包括常見的鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌等,與小細胞癌相比其癌細胞生長分裂較慢,擴散轉(zhuǎn)移相對較晚。非小細胞肺癌約占所有肺癌的80%,其中約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期,5年生存率很低。近年來隨著藥物基因組學的開展,非小細胞肺癌的藥物相關(guān)研究大幅度提升,一方面,為更好地發(fā)揮化療效應起到指導作用;另一方面越來越多的靶向藥物被研制出來,在腫瘤治療方面起到了許多令人鼓舞的成果。在肺癌的靶向治療、轉(zhuǎn)移因素、耐藥性方面我們做了許多探索。目前針對第一代靶向治療藥物EGFR-TKI,以吉非替尼和厄洛替尼為代表,對于初治的非小細胞肺癌患者,中位PFS可達10個月,隨之而來的耐藥性函待解決。因此相關(guān)領(lǐng)域一些新的蛋白基因受體研究異常火熱。本研究旨在探究是否有其他因子參與了EGFR與MET的調(diào)控,我們對全基因組中HIF-1α的類似物進行了篩查。其家族成員EPAS1在EGFR調(diào)控MET中的作用我們進行了系統(tǒng)研究,我們將HA標記的EPAS1(HA-EPAS1)與Myc標記的EGFR(Myc-EGFR)共同轉(zhuǎn)染至HCC827細胞中,并使用HA的抗體進行免疫共沉淀實驗。以確認這種結(jié)合是否具有細胞特異性,同時我們在A549中進行了相同的實驗。為了進一步探究EPAS1和T790M EGFR的結(jié)合是否為直接結(jié)合,我們使用了DTME作為交聯(lián)劑進行蛋白交聯(lián)實驗。再者,為了研究MET信號通路是否受EPAS1與T790M EGFR的相互作用影響,我們在HCC827細胞系中同時分別過表達EPAS1、野生型EGFR以及T790M EGFR,并檢測MET的表達量。關(guān)于EPAS1與T790M EGFR是否依賴于配體,我們構(gòu)建了配體結(jié)合域缺失的載體ΔN-T790M,并將其與EPAS1共同轉(zhuǎn)染至HCC827細胞中。為了探究EPAS1與T790M EGFR的相互作用對NSCLC藥物耐受的作用,我們將EPAS1與T790M EGFR共同轉(zhuǎn)染至HCC827細胞中以EPAS1載體的空載作為對照,并使用吉非替尼和埃羅替尼處理細胞,用克隆實驗檢測分別共轉(zhuǎn)染EASP1與T790M EGFR以及野生型EGFR對NSCLC對TKI處理的藥物抵抗作用。最后為了探究EPAS1與T790M EGFR的相互作用是否通過MET信號通路來發(fā)揮作用的,我們敲低了內(nèi)源的MET的表達并檢測了細胞增殖和生長情況。方法:細胞培養(yǎng)NSCLC細胞系HCC827和A549購自美國ATCC(馬納薩斯)并且從收到細胞到完成文章不超過六個月時間。細胞用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,2 m M-左旋谷酰胺的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),同時將細胞放入37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒構(gòu)建將EPAS1編碼序列克隆到N端含HA標簽的p CMV-HA質(zhì)粒中,同時將配體結(jié)合域確實的突變型EGFR(氨基酸2-620)克隆到N端含Myc標簽的pc DNA3.1質(zhì)粒中。免疫熒光將HCC817轉(zhuǎn)染HA-標記的EPAS1質(zhì)粒并將細胞培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)小室中,檢測時用4%甲醛固定三十分鐘,接著使用0.2%Triton X-100破膜5分鐘,使用5%BSA進行封閉。使用鼠源的抗HA的一抗室溫孵育并使用Alexa Fluor 488羊抗鼠熒光二抗室溫孵育30分鐘后使用DAPI作為DNA染料。在抗體孵育后,細胞用PBS清洗并用抗熒光猝滅封片劑進行封片。免疫沉淀和蛋白免疫印跡蛋白裂解使用RIPA裂解液,配方為50 m M Tris-HCl,p H 7.4,150 m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS并添加蛋白抑制劑。將裂解完的細胞用4℃的冰凍離心機12000rpm/min離心10min,將上清與瓊脂糖球體以及抗HA和抗Myc的抗體4℃共同孵育2h。將孵育后的瓊脂糖珠用裂解液清洗三遍后用最終洗脫液(50 m M Tris,p H 7.5,and 50 m M Na Cl)清洗兩遍。將瓊脂糖朱用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫下來并95℃熱變性5min,使用SDA-PAGE膠進行蛋白分離并用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脫脂奶粉的封閉液進行封閉2h,并在4℃孵育一抗過夜。在用PBST清洗后,用含辣根過氧化酶的二抗進行孵育2h后再用PBST清洗后進行爆片。蛋白交聯(lián)實驗將HCC827細胞共轉(zhuǎn)染EPAS1和野生型或突變型T790M EGFR后收集細胞并在4℃冰凍離心機中800g離心10 min并用PBS重懸。將交聯(lián)劑用DMSO溶解后備用并將其加入到細胞懸液中使終濃度為0.1m M,在4℃孵育2 h。使用RIPA裂解液進行理解并進行蛋白免疫沉淀反應。蛋白使用添加DTT或未添加DTT的SDS-PAGE上樣緩沖液進行洗脫并進行蛋白免疫印跡。RNA干擾和熒光定量PCR為了進行RNA干擾實驗,靶向MET的慢病毒載體sh RNA V2LHS_113750和V3LHS_318637購自GE Dharmacon公司。細胞使用慢病毒轉(zhuǎn)染體系并用1μg/ml嘌呤霉素進行篩選得到穩(wěn)定敲低的細胞株。為了檢驗干擾效率我們提取了細胞的總RNA并使用全式金Easy Script Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)1μg總RNA,同時使用GAPDH m RNA水平進行標準化并將所有基因表達量展現(xiàn)為相對值。細胞增殖,生長和存活分析細胞生長使用MTT法進行分析。細胞使用TKIs處理72 h后進行檢測并標準化為空白組的表達�？寺⌒纬蓪嶒炗脕頇z測細胞生長情況。所有濃度的藥物處理經(jīng)過五次單獨的檢測并展示為平均值±標準誤。數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)據(jù)都展示為平均值±標準誤。使用雙尾檢測的T檢驗來檢測兩組之間的差異,當p0.05是認為存在顯著的差異。結(jié)果:結(jié)果顯示EPAS1(NCBI Reference Sequence:NP_001421.2)作為最為同源的基因擁有與HIF-1α48%的相似的氨基酸序列。野生型的EGFR與EPAS1并無結(jié)合,然而將790蘇氨酸突變?yōu)榈鞍彼岬馁|(zhì)粒Myc-T790M與HA-EPAS1共同轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞系HCC827中后,蛋白免疫共沉淀結(jié)果顯示EPAS1與突變的EGFR具有結(jié)合。同樣在A549細胞系中也有類似的結(jié)果。同樣,在A549細胞中EASP1也只與T790M結(jié)合而不與野生的EGFR結(jié)合,這提示其相互作用不存在細胞特異性。EPAS1與野生型的EGFR確實不存在結(jié)合而在添加劑中消除DTT后能夠出現(xiàn)T790MEGFR與EPAS1相結(jié)合的帶,而添加DTT后這種結(jié)合消失了,這提示EPAS1與T790M EGFR的結(jié)合是直接結(jié)合。單獨過表達野生型EGFR和T790M EGFR能夠顯著上調(diào)MET的表達量,單獨表達EPAS1則對MET的表達量并沒有太大影響,并且同時表達EPAS1和野生型EGFR與單獨表達野生型EGFR也并未有顯著提升,然而同時表達EPAS1和T790M EGFR能夠顯著上調(diào)MET的表達。ΔN-T790M與EPAS1共同轉(zhuǎn)染后能夠顯著上調(diào)MET的表達,這提示EPAS1與T790M EGFR相互作用對MET的激活作用不依賴于配體。共同轉(zhuǎn)染EPAS1與T790M EGFR后HCC827的吉非替尼的EC50提升至10μM以上,埃羅替尼的EC50提升到5μM,而只表達T790M EGFR對照組僅為0.1μM和0.6μM,這提示EPAS1與T790M EGFR的相互作用能夠增加NSCLC對TKI抑制劑的耐受性。干擾MET后HCC827的EC50分別下調(diào)至0.005μM和0.09μM,這提示EPAS1與T790M EGFR相互作用促進NSCLC對TKI的耐藥性是通過MET信號通路來發(fā)揮作用的。結(jié)論:1在非小細胞肺癌中EPAS1作為HIF-1α同系物可與T790M EGFR相結(jié)合2 EPAS1與T790M EGFR相互作用能夠不依賴于配體結(jié)合而激活MET信號通路3 EPAS1誘導的NSCLC的TKI抵抗是通過T790M EGFR和MET信號通路來發(fā)揮作用的第二部分mi R-200a通過靶向EGFR和c-Met抑制NSCLC對吉非替尼的藥物抵抗性目的:為了研究mi R-200a在NSCLC中的作用,我們分別用q RT-PCR法檢測了NSCLC細胞株(H3255,H1975和HCC827)和正常肺細胞(MRC-5和CCD-19Lu)中mi R-200a的表達量。關(guān)于EGFR和c-Met是否為mi R-200a的直接靶點,我們構(gòu)建了包含mi R-200a匹配EGFR和c-Met 3’UTR的報告基因野生型和突變型質(zhì)粒。同時我們將EGFR和c-Met報告基因質(zhì)粒分別與mi R-200a mimics或mi R-NC mimics共同轉(zhuǎn)染至NSCLC細胞中,通過檢測熒光表達量檢測mi R-200a對EGFR和c-Met的抑制作用。為了驗證mi R-200a對NSCLC的作用效果,我們分別在H3255,H1975和HCC827細胞中過表達mi R-200a和mi R-NC,并通過細胞劃痕和侵襲實驗來檢測細胞遷移和侵襲能力。同時使用MTT實驗和Brd U實驗來檢測細胞增殖情況。最后為了檢測不同的過表達mi R-200a的NSCLC細胞對吉非替尼的影響,我們使用了細胞增殖和生長實驗來檢測細胞對不同濃度吉非替尼濃度的影響。方法:細胞培養(yǎng):人肺正常細胞MRC-5和CCD-19Lu和人肺癌細胞系H3255,H1975以及HCC827購自美國ATCC。H3255具有L858R EGFR等位基因,H1978具有L858R/T790M EGFR等位基因,而HCC827具有EGFR E746-A4750確實。細胞培養(yǎng)嚴格按照ATCC培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)并且在實驗全部完成之前不超過6個月。細胞使用含10%胎牛血清以及1%的青鏈霉素在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將10μM mi RNA寡聚核苷酸以及10μl Lipofectamine 2000分別與500μl Opti-MEM均勻分布后再充分混合并在室溫孵育20分鐘。將混合液加入到含60%融合度細胞的六孔板中,并在37℃培養(yǎng)兩天。Mi RNA轉(zhuǎn)染Hsa-mi R-200a過表達和對照寡聚核苷酸購自ABI公司其序列為5’-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3。將mi RNA寡聚核苷酸按照說明書進行轉(zhuǎn)染RNA提取和熒光定量PCR反應按說明書使用Trizol對總RNA進行提取。使用Taq Man Pri-mi RNA分析試劑盒對mi R表達量進行分析,使用RNU48作為內(nèi)參并標準化。為了檢測EGFR和c-Met m RNA的表達量使用Easy Script Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)體系對1μg RNA進行反轉(zhuǎn)。從反轉(zhuǎn)好的20μl c DNA中吸取2μl進行實時熒光定量定量PCR反應。熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸GFR和c-Metd 3’-UTR區(qū)域克隆至p MIR-REPORT報告基因質(zhì)粒中,其突變質(zhì)粒使用PCR方法進行構(gòu)建。將HCC827細胞傳到24孔板中每孔80000個細胞。使用Lipofectamine2000法將hsa-mi R-200a或mi R-contro和野生型、突變型報告基因質(zhì)粒以及p RL-TK分別轉(zhuǎn)染至細胞中。蛋白提取和蛋白免疫共沉淀蛋白使用RIPA裂解液進行提取,配方為50 m M Tris-HCl,p H 7.4,150m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脫氧膽酸鹽,0.1%SDS使用前添加蛋白抑制劑。將裂解的蛋白12,000 rpm/min 4°C離心10 min。使用SDA-PAGE膠進行蛋白分離并用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脫脂奶粉的封閉液進行封閉2h,并在4℃孵育EGFR和c-Met一抗過夜。在用PBST清洗后,用含辣根過氧化酶的二抗進行孵育2h后再用PBST清洗后進行爆片。細胞劃痕將細胞傳至六孔板中,每孔種細胞1×105個病轉(zhuǎn)染mi R-200a或?qū)φ蘸塑账帷Ｊ褂?0μl槍頭對細胞進行劃痕,去除殘余細胞用新鮮的培養(yǎng)基重新培養(yǎng)。在細胞劃痕后24h進行拍照。細胞侵襲將1×105轉(zhuǎn)染過mi R-200a和對照的細胞與無血清培養(yǎng)基重懸并傳至Matrigel覆蓋的小室上方在小室下方放置500μl含10%血清的培養(yǎng)基并在37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h后進行拍照。細胞增殖實驗吉非替尼處理和未處理細胞的增殖情況用MTT實驗和Brd U實驗進行檢測。細胞在用吉非替尼處理72后進行檢測并換算成對照細胞的相對比例。數(shù)據(jù)為五次實驗的統(tǒng)計并展示為平均值±標準誤。數(shù)據(jù)分析所有的數(shù)據(jù)都展示為平均值±標準誤。使用雙尾檢測的T檢驗來檢測兩組之間的差異,當p0.05是認為存在顯著的差異。結(jié)果:在正常的肺細胞系MRC-5和CCD-19Lu中mi R-200a的表達量接近,然而與MRC-5細胞相比,H3255細胞中mi R-200a的表達量僅為MRC-5的20%,而H1975和HCC827也只分別為33%和25%。上述結(jié)果顯示,與正常肺癌細胞相比,mi R-200a的表達量明顯下調(diào)。結(jié)果顯示mi R-200a能夠顯著抑制EGFR和c-Met的野生型熒光素酶報告基因的活性,而突變型對照組則沒有顯著變化。以上結(jié)果顯示mi R-200a能夠通過靶向EGFR和c-Met的3’UTR區(qū)域來抑制其活性。結(jié)果顯示對照組遷移的平均距離分別為281μm,326μm以及252μm,而轉(zhuǎn)染mi R-200a組遷移的平均距離顯著下降到134μm,168μm以及83μm,與對照組相比下調(diào)了至少47%。同樣與預期一樣,轉(zhuǎn)染mi R-200a的NSCLC細胞的遷移能力與對照組相比出現(xiàn)顯著下降。此外,MTT法和Brd U法檢測細胞活性和細胞增值能力,結(jié)果顯示,過表達mi R-200a能夠顯著抑制NSCLC細胞的活性和增殖能力。以上結(jié)果顯示,mi R-200a能夠顯著抑制NSCLC細胞的遷移、侵襲和細胞增殖,揭示了mi R-200a對NSCLC細胞功能的抑制作用。各轉(zhuǎn)染對照組的細胞中,含L858R EGFR突變的H3255細胞株對于吉非替尼的抵抗較小其EC50為0.07μM,同時含有L858R和T790M突變的H1975細胞對吉非替尼的耐受最為強烈,其EC50為10μM,而不含二者突變的HCC827細胞作為陰性對照其EC50為10μM。轉(zhuǎn)染mi R-200a后其EC50分別為0.008μM,0.004μM而陰性對照組則沒有明顯變化。這提示mi R-200a能夠提高NSCLC對TKI的藥物敏感性。結(jié)論:1 mi R-200a在NSCLC細胞中下調(diào)2 mi R-200a能夠直接靶向抑制EGFR和c-Met的表達3 mi R-200a抑制NSCLC細胞轉(zhuǎn)移和侵襲
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
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本文編號：2191019