【摘要】：目的探討瘦素(Leptin)促人乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3的M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)表達及其誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及機制,初步闡明Leptin通過上調(diào)糖代謝關(guān)鍵酶PKM2而影響乳腺癌EMT及其作用機制。方法1.采用蛋白質(zhì)印記法(western blotting,WB)和免疫熒光法(immunofluorescence,IF)檢測人乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468中Leptin長受體OB-Rb、短受體OB-Rt的表達;采用人源Leptin處理三株細胞,觀察細胞形態(tài)變化;WB檢測細胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達。2.Leptin處理人乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3后,采用QRT-PCR和WB,分析PKM2 m RNA及蛋白水平的變化。3.采用化學(xué)合成的PKM2-si RNA干擾乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3的PKM2,劃痕及Transwell侵襲實驗分別檢測Leptin對兩株細胞遷移及侵襲能力的影響;WB檢測Leptin對兩株細胞EMT相關(guān)標(biāo)志蛋白表達的影響。4.采用Leptin聯(lián)合PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑處理乳腺癌細胞MCF-7和SK-BR-3,WB檢測PKM2的表達。采用Leptin受體中和抗體處理乳腺癌細胞MCF-7和SK-BR-3后,WB檢測Leptin對PKM2表達及對PI3K/AKT信號通路激活的影響;采用WB檢測PI3K/AKT通路抑制劑處理后,乳腺癌細胞MCF-7和SK-BR-3中PKM2及EMT相關(guān)蛋白的表達。5.構(gòu)建穩(wěn)定干擾PKM2的乳腺癌SK-BR-3細胞株,利用該細胞株建立裸鼠移植瘤模型,測量腫瘤大小,觀察裸鼠生存期。免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測腫瘤組織EMT相關(guān)蛋白的表達,HE染色檢測腫瘤肝肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果1.WB及IF結(jié)果表明,乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-468均表達OB-Rb和OB-Rt;Leptin能引起三株細胞形態(tài)發(fā)生EMT樣改變,且下調(diào)上皮性標(biāo)志物E-cadherin,上調(diào)間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin和Fibronectin的表達。2.QRT-PCR及WB結(jié)果顯示,Leptin能顯著上調(diào)MCF-7、SK-BR-3細胞PKM2的m RNA及蛋白水平。3.為進一步探討PKM2在Leptin促乳腺癌細胞EMT過程中的作用,采用PKM2-si RNA干擾細胞表達PKM2,劃痕及Transwell實驗結(jié)果表明,MCF-7、SK-BR-3細胞的遷移和侵襲能力被抑制;WB檢測提示,細胞的E-cadherin水平升高,Vimentin、Fibronectin水平降低,即干擾細胞PKM2表達后Leptin促EMT作用被抑制。4.WB結(jié)果表明,抑制PI3K/AKT信號通路能減弱Leptin促PKM2表達的作用。采用中和性抗體封閉Leptin受體OBR,PI3K/AKT信號通路的激活被抑制,Leptin促PKM2表達的作用也被抑制。采用WB檢測發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路抑制后,Leptin促乳腺癌細胞PKM2表達及EMT的作用被抑制。5.裸鼠乳腺癌移植瘤模型分為SKBR-3、SKBR-3-LV和SKBR-3-sh PKM2組,其中SKBR-3、SKBR-3-LV為對照組,SKBR-3-sh PKM2為實驗組。實驗結(jié)果表明SKBR-3-sh PKM2組腫瘤體積、重量均明顯小于對照組。HE染色SKBR-3、SKBR-3-LV組肝肺轉(zhuǎn)移灶較SKBR-3-sh PKM2組明顯增多。瘤組織IHC結(jié)果顯示,與對照組相比,SKBR-3-sh PKM2組E-cadherin表達明顯升高,Vimentin、Fibronectin表達明顯降低,SKBR-3-sh PKM2組小鼠生存期明顯延長。結(jié)論1.Leptin促進乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468發(fā)生EMT。2.Leptin激活PI3K/AKT信號通路上調(diào)乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3的PKM2表達,進而促進乳腺癌細胞發(fā)生EMT。3.抑制PKM2能夠減弱乳腺癌細胞移植瘤的生長,延長荷瘤小鼠生存期,減少乳腺癌肝肺轉(zhuǎn)移,PKM2可能是影響乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要靶點。
[Abstract]:Objective To investigate the effect and mechanism of leptin on the expression of M2-pyruvate kinase (PKM2) and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3. Methods 1. Western blotting (WB) and immunofluorescence (IF) were used to detect the expression of Leptin long receptor OB-Rb and short receptor OB-Rt in MCF-7, SK-BR-3 and MDA-MB-468 breast cancer cells. The morphological changes of three cells were observed by human Leptin treatment. The expression of EMT-related marker protein was detected by WB. After treatment of human breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3, the changes of PKM2 m RNA and protein levels were analyzed by QRT-PCR and WB. 3. The effects of Leptin on the migration and invasion of breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3 were detected by interfering with PKM2, scratch and Transwell invasion assays with chemically synthesized PKM2-si RNA, and WB was used to detect the effects of Leptin on the migration and invasion of the cells. Leptin combined with PI3K/AKT, JAK/STAT, MAPK/ERK1/2 signal pathway inhibitors were used to treat breast cancer cells MCF-7 and SK-BR-3. WB was used to detect the expression of PKM2. Leptin receptor neutralizing antibodies were used to treat breast cancer cells MCF-7 and SK-BR-3. WB was used to detect the expression of PKM2 and activation of PI3K/AKT signaling pathway. The expression of PKM2 and EMT-related proteins in breast cancer cells MCF-7 and SK-BR-3 after treatment with PI3K/AKT pathway inhibitors was detected by WB. 5. The SK-BR-3 cell line stably interfering with PKM2 was constructed. The nude mice transplanted tumor model was established by using this cell line, the tumor size was measured and the survival time was observed. Results WB and IF results showed that breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3 and MDA-MB-468 all expressed OB-Rb and OB-Rt; Leptin could induce EMcadT-like changes in three cell lines, and down-regulate the epithelial marker E-cadherin and up-regulate the interstitial marker Vimenti Vimenti. QRT-PCR and WB results showed that Leptin could significantly up-regulate the expression of M RNA and protein of PKM2 in MCF-7, SK-BR-3 cells. 3. To further explore the role of PKM2 in the process of Leptin promoting EMT in breast cancer cells, PKM2-si RNA was used to interfere with the expression of PKM2 in cells. Scratch and Transwell experiments showed that MCF-7, SK-BR-3 cells migrated. WB assay showed that E-cadherin level increased, Vimentin and Fibronectin levels decreased, that is, Leptin-induced EMT was inhibited after interfering with PKM2 expression. 4. WB assay showed that inhibition of PI3K/AKT signaling pathway could attenuate Leptin-induced PKM2 expression. The activation of the pathway was inhibited and the effect of Leptin on PKM2 expression was inhibited. WB assay showed that the effect of Leptin on PKM2 expression and EMT in breast cancer cells was inhibited after PI3K/AKT signaling pathway was inhibited. 5. Nude mice breast cancer xenograft models were divided into SKBR-3, SKBR-3-LV and SKBR-3-sh PKM2 groups, SKBR-3-LV as control group, SKBR-3-sh PKM2 as control group. The results showed that the tumor volume and weight of SKBR-3-sh PKM2 group were significantly smaller than those of control group. The liver and lung metastases of SKBR-3, SKBR-3-LV group were significantly more than those of SKBR-3-sh PKM2 group. The survival time of R-3-sh PKM2 group mice was significantly prolonged. Conclusion 1. Leptin can promote the occurrence of EMT in breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-468. Leptin can activate PI3K/AKT signaling pathway and up-regulate the expression of PKM2 in breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3, thereby promoting the occurrence of EMT.3 in breast cancer cells. PKM2 may be an important target for breast cancer invasion and metastasis.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2178526