【摘要】：目的:研究重組腺病毒pAd5F35-IL-12成功感染人外周血單核細胞后,高表達IL-12的單核細胞是否可以誘導(dǎo)其成為抑制肝癌細胞生長的M1型巨噬細胞,探討是否與Stat-3信號通路有關(guān)。方法:采用Ficoll-Paque分離液分離新鮮的人外周血單核細胞,然后讓重組腺病毒pAd5F35-IL-12感染單核細胞。感染腺病毒48小時后的單核細胞和人肝癌細胞株(SMMC-7721和Hep3B)在共培養(yǎng)小室中進行體外共培養(yǎng),每一種肝癌細胞株都分別設(shè)立3個實驗組,分別是空白組(SMMC-7721和Hep3B),空載組(SMMC-7721/GFP和Hep3B/GFP),目的組(SMMC-7721/IL-12和Hep3B/IL-12)。分別檢測兩種肝癌細胞共培養(yǎng)體系中IL-12的表達情況,單核細胞分化表型及Stat-3信號通路的變化以及體內(nèi)外肝癌細胞的生長情況。采用熒光顯微鏡觀察感染了帶有綠色熒光蛋白的重組腺病毒pAd5F35-IL-12的單核細胞是否發(fā)出綠色熒光,使用RT-PCR方法檢測IL-12的P35、P40亞基的mRNA水平的表達情況,ELISA方法檢測共培養(yǎng)體系培養(yǎng)基中IL-12 P70蛋白的表達水平。采用流式細胞術(shù)檢測共培養(yǎng)體系中的單核細胞分化為巨噬細胞的表面分化標志cd197(m1型巨噬細胞表面分化標志)和cd206(m2型巨噬細胞表面分化標志)的平均熒光強度值mfi,分別使用定量pcr方法和elisa方法檢測共培養(yǎng)上清中巨噬細胞表型分化相關(guān)因子il-10、il-12、tgf-β、vegf-a、mmp-9的表達情況。進一步采用westernblot方法檢測共培養(yǎng)體系中過表達il-12的單核細胞的stat-3信號分子及其下游c-myc基因的變化情況。最后在體內(nèi)外分別研究肝癌細胞的生長情況,在體外實驗中,cck8法和細胞克隆實驗檢測肝癌細胞的增殖情況,流式細胞術(shù)檢測共培養(yǎng)后肝癌細胞的細胞周期變化,transwell實驗檢測肝癌細胞的侵襲能力;體內(nèi)實驗中,觀察nod/scid小鼠中成瘤情況和繪制腫瘤生長曲線,免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤生長相關(guān)指標(pcna、mvd)表達情況。結(jié)果:重組腺病毒pad5f35-il-12能夠感染新鮮分離的人外周血單核細胞,發(fā)出綠色熒光,分泌表達il-12p70蛋白;在單核細胞和肝癌細胞的共培養(yǎng)體系中,和空白組和空載組相比,目的組中過表達il-12的單核細胞cd197、il-12的表達升高,cd206、il-10、tgf-β、vegf-a、mmp-9的表達下降,stat-3和c-myc基因的mrna和蛋白水平都下降;體外實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中,和空白組和空載組相比,目的組中肝癌細胞的瑞氏染色形態(tài)變化明顯,細胞變圓,細胞核和細胞質(zhì)之間的邊界變模糊;cck-8實驗和克隆形成實驗中目的組的肝癌細胞株的細胞增殖能力下降,克隆形成率下降;目的組肝癌細胞周期g1期升高,s期下降;目的組肝癌細胞侵襲能力下降。動物移植瘤模型實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),目的組肝癌成瘤時間延長,腫瘤生長率下降,增殖細胞核抗原PCNA陽性細胞率下降,平均血管密度MVD減少。結(jié)論:重組腺病毒pAd5F35-IL-12能夠有效的感染新鮮分離的人外周血單核細胞,分泌較高水平的IL-12 P70蛋白。共培養(yǎng)體系中過表達IL-12的單核細胞可以分化為M1型巨噬細胞,其機制可能與Stat-3和c-myc信號通路的下調(diào)有關(guān)。體內(nèi)、外研究證實過表達IL-12可誘導(dǎo)單核細胞極化為M1型巨噬細胞,并且可以使與其共培養(yǎng)的肝癌細胞生長受到明顯的抑制。
[Abstract]:Objective: To investigate whether the recombinant adenovirus pAd5F35-IL-12 successfully infects human peripheral blood mononuclear cells, and whether the mononuclear cells with high expression of IL-12 can induce M1 macrophages to inhibit the growth of hepatoma cells, and explore whether it is related to the Stat-3 signaling pathway. Method: to separate fresh human peripheral blood mononuclear cells by Ficoll-Paque separation solution. The recombinant adenovirus pAd5F35-IL-12 was infected with mononuclear cells. The monocyte and human hepatoma cell line (SMMC-7721 and Hep3B) infected with adenovirus 48 hours later were co cultured in the co culture compartment, and 3 experimental groups were set up in each of the hepatoma cell lines, respectively, the blank group (SMMC-7721 and Hep3B), and the empty group (SMMC-7721/GFP and Hep3B). /GFP), the target group (SMMC-7721/IL-12 and Hep3B/IL-12). The expression of IL-12 in the co culture system of two hepatoma cells, the changes of the monocyte differentiation phenotype and the Stat-3 signaling pathway and the growth of the hepatoma cells in vivo and in vitro and in vivo were detected. The recombinant adenovirus pAd5F35- with green fluorescent protein was detected by the fluorescence microscope. Whether the monocyte of IL-12 sends out green fluorescence, uses RT-PCR method to detect the expression of mRNA level of IL-12 P35, P40 subunit, and ELISA method to detect the expression level of IL-12 P70 protein in the culture medium of co culture system. Flow cytometry is used to detect the differentiation of monocytes in the co culture system to the surface differentiation marker of macrophage. The average fluorescence intensity of 97 (M1 type macrophage surface differentiation marker) and cd206 (surface differentiation marker of M2 type macrophage) was MFI. Quantitative PCR method and ELISA method were used to detect the expression of phenotypic differentiation related factors of macrophages in co culture supernatant, IL-10, IL-12, tgf- beta, VEGF-A, MMP-9. Further Westernblot method was used. The changes in the Stat-3 signal molecules of mononuclear cells expressing IL-12 and their downstream c-myc genes in the co culture system. Finally, the growth of hepatoma cells was studied in vivo and in vitro. In vitro, the proliferation of hepatoma cells was detected by CCK8 method and cell clone test. Flow cytometry was used to detect the cell size of hepatoma cells after co culture. Cell cycle changes, Transwell test was used to detect the invasion ability of liver cancer cells. In vivo, the tumor formation of nod/scid mice was observed and the tumor growth curve was plotted. The expression of tumor growth correlation index (PCNA, MVD) was detected by immunohistochemistry. Results: recombinant adenovirus pad5f35-il-12 could infect fresh isolated human peripheral blood. Nuclear cells emit green fluorescence and secrete expression of IL-12p70 protein; in the co culture system of mononuclear and hepatocellular carcinoma cells, the expression of CD197, IL-12, cd206, IL-10, tgf- beta, VEGF-A, MMP-9, and mRNA and protein levels of Stat-3 and c-myc genes are decreased in the mononuclear cells expressing IL-12 in the mononuclear and hepatocellular carcinoma cells. The results of in vitro study found that in the co culture system, compared with the blank group and the empty group, the liver cancer cells in the target group had obvious changes in the rayon staining form, the cells became round and the boundary between the nucleus and the cytoplasm became blurred, and the cell proliferation ability of the liver cancer cell lines in the CCK-8 experiment and the clone formation experiment decreased, The formation rate of lung cancer decreased, the period G1 of liver cancer cells in the target group increased, the S phase decreased, and the invasion ability of liver cancer cells in the target group decreased. The results of animal transplantation tumor model experimental study found that the tumor growth rate of liver cancer in the target group was prolonged, the tumor growth rate decreased, the rate of PCNA positive cells of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) decreased, and the average density of blood vessel density decreased. Conclusion: recombinant human blood vessel density (MVD) decreased. Adenovirus pAd5F35-IL-12 can effectively infect fresh isolated human peripheral blood mononuclear cells and secrete a high level of IL-12 P70 protein. In co culture system, the mononuclear cells that overexpress IL-12 can differentiate into M1 type macrophages. The mechanism may be related to the lower modulation of Stat-3 and c-myc signaling pathways. In vivo, external studies have confirmed that IL-12 can be expressed. The mononuclear cells were induced to polarize M1 macrophages, and the growth of hepatoma cells co cultured with them was significantly inhibited.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2157416