【摘要】：P90核糖體S6激酶(ribosomal S6Kinase, RSK)是信號通路Raf-MEK-ERK下游重要的作用靶點(diǎn),屬于蘇氨酸絲氨酸激酶家族,迄今已發(fā)現(xiàn)此家族有4個(gè)成員RSK1-4,他們在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、生長、生存及侵襲等各種生命活動(dòng)發(fā)揮著重要的作用。有關(guān)RSK1-3與腫瘤的關(guān)系的研究報(bào)道較多,在分子和細(xì)胞水平上的作用已比較清晰,而RSK4在結(jié)直腸癌研究較少,其功能和作用尚不明確。我們用免疫組織化學(xué)系統(tǒng)地分析了103例結(jié)直腸癌及相匹配的46例癌旁組織和正常組織中RSK4蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RSK4蛋白在結(jié)直腸癌和癌旁組織和正常結(jié)直腸中表達(dá)相差較大,在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平最低,RSK4蛋白的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移數(shù)目和臨床分期早晚緊密相關(guān)。單因素,多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)RSK4低表達(dá)是結(jié)直腸癌眾多預(yù)后因素中一個(gè)相對獨(dú)立的預(yù)后較差的因子。在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和HCT116中,我們用qRT-PCR和Western Blot檢測到RSK4呈低表達(dá)狀態(tài),利用Lipofectamin2000技術(shù),我們觀察到轉(zhuǎn)染RSK4基因過表達(dá)后,用MTT法檢測到RSK4可以明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外生長,隨著時(shí)間的延長,抑制效果越明顯,48至60小時(shí)達(dá)高峰,抑制率為60-70%。流式細(xì)胞儀檢測到轉(zhuǎn)染RSK4基因后,SW480和HCT116細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了顯著的變化,G0/1期細(xì)胞比例上升較為明顯,DNA合成期(S期)細(xì)胞比例顯著下降。為了進(jìn)一步觀察腫瘤的侵襲能力,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RSK4基因的SW480和HCT116細(xì)胞侵襲能力明顯低于對照組。RSK4對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有重要的調(diào)節(jié)作用,而臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤的間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化密不可分。本文選擇了EMT相關(guān)分子Claudin-2, E-cadherin, P53, Snail,TGF-β,Twist及Vimentin,觀察轉(zhuǎn)染RSK4基因后各EMT相關(guān)分子的mRNA及蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin在轉(zhuǎn)染RSK4組呈高表達(dá),Snail在SW480, HCT116兩株細(xì)胞呈低表達(dá),而Claudin-2, P53, TGF-β,Twist, Vimentin的mRNA表達(dá)情況變化不大。其蛋白表達(dá)也有類似的情況,說明RSK4對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移減弱可能是通過調(diào)節(jié)E-cadherin和Snail來實(shí)現(xiàn)的。本研究證實(shí)了RSK4可能為結(jié)直腸癌的抑癌基因,抑制結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移,靶向RSK4有望成為結(jié)直腸癌的另一有效治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:Ribosomal S6 kinase (RSK) is an important target in the downstream of Raf-MEK-ERK signaling pathway and belongs to the threonine serine kinase family. Up to now, four members of the family RSK1-4 have been found to regulate cell proliferation, movement and growth. Survival and invasion and other life activities play an important role. There are many reports about the relationship between RSK1-3 and tumor, the role of RSK4 in the molecular and cellular level has been more clear, but RSK4 in colorectal cancer research is less, its function and role is not clear. We systematically analyzed the expression of RSK4 protein in 103 cases of colorectal cancer and 46 matched adjacent tissues and normal tissues by immunohistochemistry. The results showed that the expression of RSK4 protein was significantly different in colorectal cancer and adjacent tissues and normal colorectal tissues. The expression level of RSK4 protein was the lowest in colorectal cancer tissues and the malignant degree of colorectal cancer. The number of lymph node metastases is closely related to the clinical stage. Univariate and multivariate Cox risk models showed that low expression of RSK4 was a relatively independent and poor prognostic factor among many prognostic factors in colorectal cancer. In SW480 and HCT116 cells of colorectal cancer, we detected the low expression of RSK4 by qRT-PCR and Western Blot. Using Lipofectamin2000 technique, we observed that after transfection of RSK4 gene, RSK4 could significantly inhibit the growth of colorectal cancer cells in vitro by MTT assay. With the prolongation of time, the inhibitory effect reached the peak at 48 ~ 60 hours, and the inhibition rate was 60-70. Flow cytometry showed that the cell cycle of SW480 and HCT116 cells changed significantly after transfection of RSK4 gene. The proportion of G0 / 1 phase cells increased significantly and the proportion of HCT116 cells decreased significantly in S phase. In order to further observe the invasiveness of tumor and the results of Transwell experiment, it was found that the invasion ability of SW480 and HCT116 cells transfected with RSK4 gene was significantly lower than that of control group. RSK4 had an important regulatory effect on tumor invasion and metastasis. Both clinical and basic experiments have confirmed that invasion and metastasis of tumor are closely related to the transformation of interstitial epithelium. The EMT related molecules Claudin-2, E-cadherin, p53, Snail-TGF- 尾 Twist and Vimentin were selected to analyze the expression of mRNA and proteins of EMT related molecules after transfection of RSK4 gene. The results showed that E-cadherin was highly expressed in RSK4 group and low in HCT116 cells. However, the expression of mRNA in Claudin-2, p53, TGF- 尾 Twistand Vimentin was not changed. The expression of RSK4 protein is similar, suggesting that the decrease of invasion and metastasis of RSK4 may be achieved by regulating E-cadherin and Snail. This study confirmed that RSK4 may be a tumor suppressor gene for colorectal cancer and inhibit invasion and metastasis of colorectal cancer. Targeted RSK4 may become another effective therapeutic target for colorectal cancer.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34

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本文編號：2153231