【摘要】：研究背景:目前肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的80%。晚期NSCLC預后差,侵襲和轉移是其主要的致死原因。因此,研究NSCLC轉移和侵襲的分子機理、探索有關的分子靶標,成為目前亟待解決的課題。研究目的:本課題重點研究DAL-1基因在NSCLC侵襲與遷移中的作用機理,以希望為NSCLC的臨床治療提供新的靶標與理論基礎。研究方法:根據人類DAL-mRNA編碼序列,設計并合成靶標DAL-1的3條特異性DAL-1 shRNA表達質粒(pGPU6/GFP/Neo-sh710、sh1329、sh1436)和陰性對照質粒(pGPU6/GFP/Neo-shNC);脂質體介導法將重組質粒轉染到NCI-H460細胞系中,并對穩(wěn)定轉染的細胞進行克隆,使用Western印跡和RT-PCR檢測DAL-1基因的表達水平,并計算表達抑制率。MTT法檢測轉染后的NCI-H460增殖水平,Transwell小室檢測侵襲和遷移能力,討論細胞抑制DAL-1后的侵襲和遷移水平。以R語言為基礎,以Bioconductor為編程環(huán)境,利用多種成熟的軟件包設計了用于分析和挖掘基因芯片數據的系統(tǒng)。下載GEO中已經上傳的Affymetrix寡核苷酸基因芯片,包含人類NSCLC的原始數據GSE33532,對該基因芯片的原始數據進行了包括數據下載、標準化處理、質控、差異基因的篩選與分析、GO分析、聚類以及通路總結,進一步分析基因調控網絡以及分子相互作用。研究結果:1.DAL-1基因的RNAi沉默效應影響NCI-H460細胞設計和構建靶向DAL-1的pGPU6/GFP/Neo-DAL-1shRNA質粒和陰性對照質粒pGPU6/GFP/Neo-shNC,建立DAL-L穩(wěn)定沉默的細胞NCI-H460-sh1329和陰性對照NCI-H460-shNC細胞。與陰性對照和空白質粒(NCI-H460/ET)相比,NCI-H460-sh1329組DAL-1細胞抑制率采用RT-PCR法檢測達到88.17%,Western blot檢測也得到了類似的結果。因此,認為sh1329有效的抑制了dal-1的表達,被稱之為nci-h460-sh1329。nci-h460-shnc與nci-h460/et的dal-1表達抑制率并沒有顯著性的改變。2.抑制dal-1對nci-h460侵襲和遷移能力的影響采用mtt法檢測細胞增殖能力,我們發(fā)現與陰性對照組nci-h460-shnc和空質粒轉染組nci-h460/et相比,nci-h460-sh1329的增殖更快(p0.05)。采用基底膜侵襲實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力,我們發(fā)現與陰性對照組nci-h460-shnc和空質粒轉染nci-h460/et相比,nci-h460-sh1329細胞的侵襲和遷移顯著增加(p0.05)。3.dal-1/4.1b的缺失或過表達改變了emt轉移標記物的表達通過真核細胞轉染shrna質粒的方法抑制dal-1/4.1b的表達后e-cadherin和β-catenin的表達下降,而vimentinb表達上升;反之,dal-1/4.1b的過表達則起到相反的效果。4.tgf-β誘導dal-1/4.1b的表達經tgf-β誘導后dal-1/4.1b的mrna及蛋白表達水平顯著增加。5.nsclc生物信息學分析篩選到gse33532數據組的49個差異表達基因,其中多組基因都已經在實驗中證實與nsclc存在密切相關的聯系,其中血管平滑肌細胞收縮通路是nsclc的關鍵調節(jié)單位。結論:成功構建dal-1shrna表達質粒(pgpu6/gfp/neo-sh710、sh1329、sh1436)和陰性對照質粒(pgpu6/gfp/neo-shnc);建立了穩(wěn)定的dal-1的沉默nci-h460-sh1329和陰性對照nci-h460-shnc細胞系。抑制dal-1后,nci-h460的增殖、遷移和侵襲水平升高,表明dal-1能抑制非小細胞肺癌遷移和侵襲。成功構建了生物信息學系統(tǒng)分析得到nsclc與正常肺組織細胞的差異基因以關鍵通路。本研究的創(chuàng)新性之處:1.靶向dal-1構建pgpu6/gfp/neo-dal-1shrna表達載體,自行設計sirna序列。實驗結果說明sirna可以有效抑制nci-h460的dal-1表達水平,通過構建dal-1穩(wěn)定抑制的細胞株,可以為探索dal-1基因在nsclc中的作用機理提供了合適的模式細胞;2.采用RNAi技術分析DAL-1在NCI-H460增殖、遷移和侵襲的功能水平,DAL-1與NSCLC轉移侵襲等的關系并討論其作用機理,為進一步探索NSCLC的產生與發(fā)展提供理論基礎。3.利用生物信息學方法分析GEO中的GSE33532的基因數據,通過差異基因和通路分析找到關鍵的調節(jié)單位血管平滑肌細胞收縮通路,為今后進一步研究肺癌中分子作用機制提供基礎。
[Abstract]:Background: at present, lung cancer is the highest incidence and death rate of malignant tumors in the world, of which Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for the poor prognosis of 80%. in the late 80%. of all lung cancers. Invasion and metastasis are the main causes of death. Therefore, the molecular mechanism of NSCLC metastasis and invasion is studied and the related molecular targets are explored. The purpose of this study is to focus on the mechanism of the DAL-1 gene in the invasion and migration of NSCLC so as to provide a new target and theoretical basis for the clinical treatment of NSCLC. Research methods: 3 specific DAL-1 shRNA expression plasmids, based on the human DAL-mRNA coding sequence, are designed and incorporated into the target DAL-1. PGPU6/GFP/Neo-sh710, sh1329, sh1436) and negative control plasmids (pGPU6/GFP/Neo-shNC). The recombinant plasmid was transfected into the NCI-H460 cell line by liposome mediated method, and the stable transfected cells were cloned. The expression level of DAL-1 gene was detected by Western blot and RT-PCR, and the expression inhibition rate.MTT method was used to detect the NCI-H460 of the transfected NCI-H460. Proliferation level, Transwell cell detection of invasion and migration ability, discuss the invasion and migration level after cell inhibition of DAL-1. Based on R language and using Bioconductor as the programming environment, a variety of mature software packages are used to design a system for analyzing and mining gene chip data. Download the Affymetrix oligonucleotides that have been uploaded in GEO. Because of the chip, including the original data GSE33532 of human NSCLC, the original data of the gene chip were carried out including data downloading, standardization, quality control, screening and analysis of differential genes, GO analysis, clustering and pathway summary, further analysis of gene regulation network and molecular interaction. Research results: RNAi silencing of 1.DAL-1 gene. The effect affected NCI-H460 cells to design and construct the pGPU6/GFP/Neo-DAL-1shRNA plasmid and negative control plasmid pGPU6/GFP/Neo-shNC targeting DAL-1, to establish DAL-L stable silent cells NCI-H460-sh1329 and negative control NCI-H460-shNC cells. Compared with negative control and blank plasmid (NCI-H460/ET), the inhibition rate of DAL-1 cells in NCI-H460-sh1329 group The detection of 88.17% and Western blot detected by RT-PCR method also obtained similar results. Therefore, it is believed that sh1329 effectively inhibits the expression of DAL-1, which is called the DAL-1 expression inhibition rate of nci-h460-sh1329.nci-h460-shnc and nci-h460/et and has no significant change in the effect of.2. inhibition DAL-1 on NCI-H460 invasion and migration The proliferation ability of the cells was detected by the method. We found that the proliferation of nci-h460-sh1329 was faster than that of the negative control group nci-h460-shnc and the empty plasmid transfection group nci-h460/et (P0.05). The invasion and migration ability of the cells was detected by the basement membrane invasion test. We found that the NCI-H460 was compared with the negative control group, nci-h460-shnc and empty plasmid transfection nci-h460/et, NCI-H460. The invasion and migration of -sh1329 cells increased significantly (P0.05) the deletion or overexpression of.3.dal-1/4.1b changed the expression of EMT transfer markers by transfecting shRNA plasmids into the eukaryotic cells to inhibit the expression of dal-1/4.1b and the expression of E-cadherin and beta -catenin, while the expression of vimentinb increased; conversely, the overexpression of dal-1/4.1b was in phase. The inverse effect of.4.tgf- beta induced expression of dal-1/4.1b by tgf- beta induced mRNA and protein expression level of dal-1/4.1b significantly increased.5.nsclc bioinformatics analysis to screen 49 differentially expressed genes in the gse33532 data group, and many of these genes have proved to be closely related to NSCLC in the experiment, including vascular smooth muscle. The cell contraction pathway is the key regulating unit of NSCLC. Conclusion: the dal-1shrna expression plasmid (pgpu6/gfp/neo-sh710, sh1329, sh1436) and negative control plasmid (pgpu6/gfp/neo-shnc) were successfully constructed, and a stable DAL-1 silencing nci-h460-sh1329 and negative control nci-h460-shnc cell line were established. The proliferation, migration and invasion of NCI-H460 were inhibited after DAL-1. The level of DAL-1 can inhibit the migration and invasion of non-small cell lung cancer. It has successfully constructed a bioinformatics system to analyze the differential genes between NSCLC and normal lung tissue as a key pathway. The innovation of this study is: 1. target to DAL-1 to construct pgpu6/gfp/neo-dal-1shrna surface vector and design siRNA sequence. Experimental results say SiRNA can effectively inhibit the DAL-1 expression of NCI-H460. By constructing a DAL-1 stable cell line, it can provide a suitable model cell for exploring the mechanism of DAL-1 gene in NSCLC; 2. the function level of DAL-1 in NCI-H460 proliferation, migration and invasion, DAL-1 and NSCLC metastasis are analyzed by RNAi technique and the relationship between DAL-1 and NSCLC metastasis and so on The mechanism of its action is discussed to provide a theoretical basis for further exploration of the production and development of NSCLC..3. is used to analyze the gene data of GSE33532 in GEO by bioinformatics method, and the key regulatory unit vascular smooth muscle cell contraction pathway is found through differential gene and pathway analysis, which can further study the mechanism of molecular action in lung cancer in the future. For the foundation.
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：2144861