【摘要】：研究背景胰腺癌是預后最差的消化道腫瘤之一,這一方面是由胰腺癌高度惡性的生物學行為決定,另一方面也與胰腺癌增殖、轉移機制不明確,缺乏有效治療藥物有關。研究表明STUB1蛋白在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,我們前期的研究也證實STUB1可以抑制胰腺癌的增殖與轉移等生物學行為。然而STUB1的上游調(diào)控機制尚不明確,僅有一篇文章報道在小鼠體內(nèi)miR-764-5p可以調(diào)控STUB1的表達。因此,在胰腺癌中研究micro RNA(miRNAs)調(diào)控STUB1的分子機制,將有望加深對胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機制的了解。研究目的探索miR-1178可否在胰腺癌細胞中靶向調(diào)節(jié)STUB1的表達。研究miR-1178在胰腺癌中的生物學功能。明確miR-1178調(diào)控胰腺癌惡性生物學行為的分子機制。檢測胰腺癌組織中miR-1178的表達水平,評估其臨床價值。研究方法生物信息學方法預測可能調(diào)控STUB1的miRNA;雙螢光素酶報告基因實驗驗證STUB1是否是miR-1178的靶基因;實時定量PCR檢測miRNA及STUB1 mRNA的表達水平;通過CCK法檢測細胞增殖;流式細胞術檢測細胞周期;Transwell法檢測細胞侵襲和遷移能力;免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達水平;通過慢病毒載體轉染,建立穩(wěn)轉miR-1178的細胞株,在裸鼠體內(nèi)觀察miR-1178對腫瘤生長的影響;采用原位雜交檢測胰腺癌組織中miR-1178的表達水平,卡方檢驗分析miR-1178的表達與臨床參數(shù)之間的關聯(lián)性。單因素及多因素生存分析評估m(xù)iR-1178的預后價值。研究結果1.靶向調(diào)控STUB1的miRNA預測及篩選通過生物信息學分析提示 hsa-miR-4716-3p,hsa-miR-1178,hsa-miR-4690-3p,hsa-miR-556-3p可能是STUB1的潛在上游調(diào)控分子。雙螢光素酶報告基因實驗表明:僅在共轉染miR-1178mimics和STUB1野生型mRNA載體時,螢光素酶活性顯著降低。western blot結果提示:上調(diào)miR-1178的表達水平,可以抑制STUB1蛋白的表達,反之,下調(diào)miR-1178的表達水平,可以增加STUB1蛋白的表達。2.MiR-1178對胰腺癌細胞惡性表型的調(diào)控作用在胰腺癌細胞株PANC-1及BxPC-3中上調(diào)miR-1178的表達水平可以顯著促進胰腺癌細胞增殖、侵襲、轉移以及S期細胞百分比(P0.05);體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定過表達miR-1178的胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的體積和重量顯著高于對照組(P0.05)。反之,可以觀察到相反的實驗結果(P0.05)。3.MiR-1178調(diào)控胰腺癌生物學行為的分子機制在胰腺癌細胞株PANC-1,BxPC-3中過表達miR-1178時,EGFR表達水平增高,AKT的第473位點絲氨酸的磷酸化水平明顯增高,而總AKT的表達水平未發(fā)生變化,p21蛋白的表達水平明顯降低(P0.05)。當下調(diào)miR-1178時,可以觀察到相反的結果(PP0.05)。過表達miR-1178時,SRC的第416位點酪氨酸的磷酸化水平明顯增高,而總SRC的表達水平未發(fā)生變化,E-Cadherin蛋白的表達水平明顯降低。而下調(diào)miR-1178可以觀察到相反的結果(P0.05)。為了驗證miR-1178是否通過抑制STUB1表達,激活了增殖和侵襲轉移相關的EGFR/AKT/p21與EGFR/SRC/E-cadherin信號通路,我們進一步在過表達miR-1178的PANC-1細胞株中轉入了 STUB1基因質粒。發(fā)現(xiàn)STUB1可以逆轉miR-1178介導的胰腺癌增殖、侵襲和轉移,并且抑制PANC-1細胞從G1向S期的轉化。進一步進行western blot分析發(fā)現(xiàn),STUB1抑制了 EGFR/AKT/p21及EGFR/SRC/E-cadherin 通路的表達(P0.05)。4.胰腺癌組織中miR-1178的表達水平與臨床病理參數(shù)及預后的相關性胰腺癌組織中miR-1178的表達水平顯著高于癌旁組織(P0.05)。胰腺癌組織中miR-1178表達水平與淋巴結轉移呈正相關(P0.05)。單因素生存分析發(fā)現(xiàn)TNM分期、腫瘤分化程度、miR-1178表達水平與患者預后相關。MiR-1178高表達的患者的中位生存時間顯著低于miR-1178低表達的患者(P=0.014)。多因素生存分析發(fā)現(xiàn),TNM高分期(Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ)及組織miR-1178高表達水平是胰腺癌患者預后不良的獨立危險因素(分別為P=0.049,HR=1.866;P=0.025,HR=2.364)。結論1.MiR-1178可靶向結合于STUB1 mRNA 3'-UTR區(qū)域,通過翻譯抑制的方式,下調(diào)STUB1蛋白的表達。2.MiR-1178可以促進胰腺癌細胞增殖、加速G1/S期轉化、促進細胞遷移和侵襲能力,同時可以增加胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長能力。3.MiR-1178促癌功能的分子機制為miR-1178通過靶向抑制STUB1表達,提高了 EGFR的表達,從而激活了其下游的EGFR/AKT/p21以及EGFR/SRC/E-cadherin 信號通路。4.胰腺癌組織中miR-1178表達水平顯著高于癌旁組織。胰腺癌miR-1178高表達是患者預后不良的獨立危險因素,并且miR-1178表達水平與淋巴結分期呈正相關,提示miR-1178可能成為新的判斷胰腺癌患者預后的標志物。
[Abstract]:The expression level of miR - 1178 in pancreatic cancer was investigated . The expression level of miR - 1178 in pancreatic cancer was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.05 ) . Conclusion : 1 . MiR - 1178 can target the expression of STUB1 mRNA in the region of STUB1 mRNA . 2 . MiR - 1178 can promote the proliferation of pancreatic cancer cells , accelerate the transformation of G1 / S phase , promote cell migration and invasion ability .
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9

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本文編號：2121711