本文選題：放射-基因治療 + 輻射防護(hù)�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景放療是腫瘤綜合性治療中不可或缺的核心技術(shù)之一,在對腫瘤的局部控制中,輻照不可避免的會對腫瘤周圍的正常組織造成損傷。為降低輻照對正常組織的損傷,輻照的劑量和時間會受到嚴(yán)格限制,在一定程度上也制約了放療的治療效果。多葉準(zhǔn)直器、精確的固定技術(shù)、輻射防護(hù)劑等常用來減輕放射性損傷,但是效果并不理想,并且輻射防護(hù)劑缺乏靶向性,同時也會對腫瘤組織起到保護(hù)作用,從而降低了放療的效果。放療增敏劑也存在類似的問題,在對腫瘤起到放療增敏效應(yīng)的同時,往往也會增強(qiáng)照射野內(nèi)正常組織的敏感性,導(dǎo)致放射損傷加重�；蛑委熓悄壳澳[瘤治療的熱點(diǎn),通過激活抑癌基因、引入細(xì)胞毒性基因、阻斷癌基因、提高腫瘤免疫原性、改變腫瘤微環(huán)境等策略起到有效的抑瘤作用。SOD2是定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)的超氧化物歧化酶,可以清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基,是細(xì)胞對抗氧化損傷的重要機(jī)制,也被視為效果確切的輻射防護(hù)劑。另有多項研究表明,SOD2具有抑癌基因的作用,能抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,并且能提高腫瘤細(xì)胞對放射治療的敏感性。然而,由于目前缺乏靶向輻射野的有效基因轉(zhuǎn)染方法以及對導(dǎo)入的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,從而限制了SOD2基因治療在臨床的推廣應(yīng)用。Egr-1基因的啟動子區(qū)域含有6個CAr G盒,該區(qū)域為輻照誘導(dǎo)調(diào)控序列,可直接感受輻照刺激。構(gòu)建含有CAr G盒的嵌合啟動子,可以優(yōu)化啟動子的啟動效率,降低本底表達(dá)。通過構(gòu)建下游連接SOD2基因的輻射誘導(dǎo)型嵌合啟動子,有望通過控制輻照劑量和時間對SOD2基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控,賦予SOD2基因治療時空限制性表達(dá)的特點(diǎn)。目的為解決目前放療增敏中 增敏腫瘤和正常損傷加重并存‖的臨床難題,本課題嘗試構(gòu)建輻照誘導(dǎo)型嵌合啟動子驅(qū)動的SOD2慢病毒過表達(dá)載體,通過控制輻照的劑量和時間,不僅可以實現(xiàn)靶向性、可調(diào)控性基因治療,還同時實現(xiàn)對腫瘤的放療增敏作用和對正常組織的輻射保護(hù)作用。這樣在腫瘤放療時兼有保護(hù)正常組織和抑制腫瘤細(xì)胞的作用,不僅可以提高腫瘤的放射治療的效果,還能減低放療對正常組織的損傷,提高腫瘤患者的生存質(zhì)量;鑒于此,靶向SOD2的基因治療有望在今后的腫瘤放射治療中有較好的應(yīng)用前景。方法1.含有報告基因和治療基因的慢病毒制備:全基因合成含有CAr G盒-CMV基礎(chǔ)啟動子的嵌合啟動子片段,以慢病毒載體p LVX-Ac GFP1-N1為骨架,分3步克隆策略構(gòu)建輻照誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的治療基因慢病毒載體p LVX-C9BC-SOD2-T2A-Ac GFP1和報告基因慢病毒載體p LVX-C9BC-Ac GFP1-N1。經(jīng)酶切、測序驗證構(gòu)建成功后,擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的stbl3菌株,去內(nèi)毒素大提質(zhì)粒,以293FT細(xì)胞株為工具細(xì)胞,三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝,測定病毒滴度。2.嵌合啟動子的輻射誘導(dǎo)特性和量化調(diào)控特征:報告基因慢病毒和治療基因慢病毒分別感染HT-29細(xì)胞株和CCD841 Co N細(xì)胞株,藥物篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。以不同的照射劑量處理穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后,不同時間點(diǎn)觀察HT-29和CCD 841 Co N穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株報告基因和治療基因的表達(dá),以明確輻照誘導(dǎo)型啟動子的啟動活性和特點(diǎn)。3.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株輻射處理后SOD2表達(dá)及表型變化:HT-29和CCD 841 Co N穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株輻照處理后,檢測下游治療基因SOD2的表達(dá);觀察不同處理組的細(xì)胞增殖、生長、凋亡的變化。4.輻射啟動SOD2基因治療裸鼠移植瘤的體內(nèi)實驗研究:首先用HT-29細(xì)胞株建立BALB/c裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型構(gòu)建成功后,局部注射治療基因慢病毒并在72h后給予輻照處理,觀察治療基因表達(dá)情況以及腫瘤生長曲線、組織病理學(xué)變化和原位凋亡情況。結(jié)果1.成功構(gòu)建報告基因慢病毒p LVX-C9BC-Ac GFP1-N1和治療基因慢病毒p LVX-C9BC-SOD2-T2A-Ac GFP1,經(jīng)測序驗證序列正確。病毒包裝后測定滴度在5′108TU/ml以上,滿足實驗要求。嘌呤霉素藥物篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,擴(kuò)增培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆谩?.HT-29和CCD 841 Co N穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株實驗表明,輻照誘導(dǎo)型嵌合啟動子能在2Gy照射下有效啟動下游基因的表達(dá),照射處理后24h報告基因Ac GFP1和治療基因SOD2表達(dá)量開始增加,至48h接近平臺期。3.體外實驗發(fā)現(xiàn),含治療基因的HT-29穩(wěn)轉(zhuǎn)株在6Gy輻照處理后,SOD2表達(dá)明顯增高,細(xì)胞的增殖和生長較之于對照組明顯受到抑制,凋亡比率增加。含治療基因的CCD 841 Co N穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在輻照處理后,SOD2表達(dá)明顯增高,較之于對照組細(xì)胞增殖和生長受到較小抑制,凋亡比率相對較低。4.體內(nèi)實驗,成功建立HT-29 BALB/c裸鼠移植瘤模型,分組后給予慢病毒注射,72h進(jìn)行6Gy局部照射處理。觀察發(fā)現(xiàn),較之于對照組荷瘤裸鼠,注射治療基因慢病毒的裸鼠局部輻照后,腫瘤細(xì)胞內(nèi)SOD2表達(dá)水平顯著增高,腫瘤生長遲緩,凋亡細(xì)胞增多;注射治療基因的皮膚組織凋亡細(xì)胞減少。結(jié)論由串聯(lián)的CAr G盒和CMV基礎(chǔ)啟動子構(gòu)成的嵌合型啟動子具有明顯的輻射誘導(dǎo)特性,在輻射處理下能有效啟動下游基因的表達(dá),并能在一定范圍內(nèi)根據(jù)輻射劑量對下游基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。體內(nèi)外實驗證明,聯(lián)合應(yīng)用放療及SOD2基因治療,對腫瘤細(xì)胞具有放療增敏效應(yīng),能有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長;同時對正常細(xì)胞和組織有輻射保護(hù)作用,降低輻射野內(nèi)正常細(xì)胞的凋亡率。
[Abstract]:鑳屾櫙鏀劇枟鏄偪鐦ょ患鍚堟，

本文編號：2105855