本文選題：FOXP3 + COX2　； 參考：《第四軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：背景結腸癌是發(fā)病率較高的癌癥之一,經(jīng)傳統(tǒng)治療后經(jīng)常發(fā)生復發(fā)、轉(zhuǎn)移,雖然其具體的機制至今仍未完全闡明,但是腫瘤內(nèi)少數(shù)具有自我更新、無限分化以及化療抵抗的腫瘤干細胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在被認為在腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中起著主要的作用。近年來,用CSCs理論來解釋腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移受到了科學家們的廣泛認可,因此,清除CSCs在腫瘤的治療過程中十分重要。環(huán)氧合酶-2(COX2)是環(huán)氧合酶(COX)同工酶中的一種,它是花生四烯酸向前列腺素(包含前列腺素E2,PGE2)代謝轉(zhuǎn)化所必需的酶。研究發(fā)現(xiàn),COX2和PGE2在促進干細胞自我更新過程中發(fā)揮了很重要的作用。近年來也有研究發(fā)現(xiàn):COX2在結腸癌以及其它種類CSCs中表達上調(diào);COX2特異性抑制劑可以降低結腸癌干細胞樣球體(Colonosphere)的形成效率(Sphere formation efficiency)。但是COX2在結腸癌干細胞(Colon Cancer Stem Cells,CCSCs)中異常表達的機制還不是很明了。因此,尋找能夠抑制COX2的分子在CCSCs的研究中十分重要。FOXP3(Forkhead box protein 3)是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory cells,Tregs)標志性分子,通過調(diào)節(jié)Tregs細胞功能發(fā)揮免疫抑制作用。近年來的研究表明,FOXP3也高表達于結腸癌以及其它腫瘤細胞中。在乳腺癌、卵巢癌以及其它癌癥中發(fā)揮抑癌作用。我們課題組在胃癌的研究中證明,FOXP3可以通過與NF-κB的相互作用抑制其活性,進而抑制COX2的表達水平,從而發(fā)揮對腫瘤的抑制功能。這提示FOXP3是一個具有抑癌作用的基因,能夠通過與NF-κB相互作用抑制腫瘤。但是FOXP3在CSCs形成和自我更新中的作用尚不清楚。目的本研究主要深入研討FOXP3對CCSCs自我更新的影響及其具體的分子機制。方法1.通過幾種不同的人結腸癌細胞系在特定培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)Colonosphere;通過Real-Time PCR和Western Blot實驗分析結腸癌細胞和Colonosphere中FOXP3和COX2的表達差異以及其相關性。2.通過感染腺病毒的方法過表達/干涉結腸癌細胞HT29中FOXP3的表達量,然后培養(yǎng)Colonosphere;通過顯微鏡觀察分析過表達/干涉FOXP3對Colonosphere形成效率的影響;通過側(cè)群細胞(Side population cells,SP)實驗分析過表達/干涉FOXP3對SP細胞比例的影響;通過Real-Time PCR分析過表達/干涉FOXP3對CCSCs表面標志物的影響;通過小鼠移植瘤實驗分析過表達/干涉FOXP3對CCSCs在小鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。3.通過免疫共沉淀(Co-IP)實驗分析FOXP3和NFκB亞基p65蛋白相互作用;通過Real-Time PCR和Western Blot分析過表達/干涉FOXP3對COX2基因和蛋白質(zhì)表達水平的影響以及同時干涉FOXP3和p65對COX2基因和蛋白質(zhì)表達水平的影響;通過Luciferase報告基因分析過表達FOXP3對COX2啟動子活性的影響以及過表達FOXP3的同時利用TNFα誘導p65入核對COX2啟動子的影響;染色質(zhì)免疫沉淀分析(CHIP)實驗檢測FOXP3是否與COX2啟動子中的p65位點結合。4.通過感染腺病毒的方法培養(yǎng)干涉FOXP3、干涉COX2以及同時干涉FOXP3和COX2的結腸癌細胞HT29,然后培養(yǎng)Colonosphere;通過顯微鏡觀察分析干涉COX2對由低表達FOXP3引起的Colonosphere形成效率增強的影響;通過SP實驗分析干涉COX2對由低表達FOXP3引起的SP細胞比例增高的影響;通過Real-Time PCR分析干涉COX2對由低表達FOXP3引起的CCSCs表面標志物表達水平升高的影響;通過小鼠移植瘤實驗分析干涉COX2對由低表達FOXP3引起的CCSCs在小鼠體內(nèi)成瘤能力增強的影響。結果1.在幾種結腸癌細胞系中成功富集得到了經(jīng)典的神經(jīng)樣球體Colonosphere,通過Real-Time PCR以及流式細胞術分析發(fā)現(xiàn),與結腸癌細胞相比,Colonosphere中CCSCs表面標志物表達水平顯著升高,能夠?qū)⑵湟暈镃CSCs來開展后面的實驗。Real-Time PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):與對應的人結腸癌細胞相比,FOXP3在CCSCs中的表達水平有明顯的降低;而作為FOXP3下游靶基因的COX2,隨著FOXP3在CCSCs中表達量的降低,其表達量有顯著升高。在CCSCs中,兩者的表達水平呈負相關。2.通過在顯微鏡下觀察分析過表達/干涉FOXP3的HT29培養(yǎng)的Colonosphere,結果表明,過表達FOXP3可以降低Colonosphere的形成效率;SP實驗結果表明,過表達FOXP3可以降低SP細胞的比例;Real-Time PCR檢測結果表明,過表達FOXP3可以降低CCSCs多種表面標志物的表達水平;小鼠移植瘤實驗結果顯示,過表達FOXP3可以降低CCSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。相反,干涉FOXP3可以增強Colonosphere的形成效率;增高SP細胞的比例;增高CCSCs表面標志物的表達水平;增強CCSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。3.免疫共沉淀實驗結果表明,CCSCs中存在著FOXP3與p65蛋白相互作用;Real-Time PCR和Western Blot實驗結果表明,過表達FOXP3可以降低CCSCs中COX2的m RNA和蛋白表達水平;相反,干涉FOXP3可以升高CCSCs中COX2的m RNA以及蛋白質(zhì)的表達水平;而在干涉FOXP3的同時干涉p65,由低表達FOXP3引起的COX2 m RNA以及蛋白質(zhì)的表達量升高的作用會受到拮抗;Luciferase報告基因結果顯示,過表達FOXP3可以降低COX2啟動子的活性,而由TNFα誘導的p65入核可以拮抗由高表達FOXP3引起的COX2基因啟動子活性受到抑制的作用;CHIP實驗結果顯示,FOXP3可以和COX2基因啟動子上的p65位點相互結合。4.通過在顯微鏡下觀察分析干涉FOXP3以及同時干涉FOXP3和COX2的HT29培養(yǎng)的Colonosphere,結果表明,干涉FOXP3可以增強Colonosphere的形成效率;SP實驗結果表明,干涉FOXP3可以增加SP細胞的比例;Real-Time PCR檢測結果顯示,干涉FOXP3可以增強CCSCs表面標志物的表達水平;小鼠移植瘤實驗結果表明,干涉FOXP3可以增強CCSCs在小鼠體內(nèi)的形成腫瘤的能力。而在干涉FOXP3的同時干涉COX2,由低表達FOXP3引起的這些CCSCs自我更新能力增強的作用會受到抑制。結論在CCSCs中,FOXP3表達下調(diào),而COX2表達上調(diào),兩者的表達水平呈負相關。FOXP3可以顯著降低CCSCs的自我跟新能力。FOXP3可能通過與p65相互作用從而抑制NFκB介導的COX2轉(zhuǎn)錄激活。FOXP3通過COX2對CCSCs的自我更新起著負性調(diào)節(jié)的作用。因此,我們得出結論:FOXP3可能通過FOXP3/NFκB-COX2信號軸抑制CCSCs的自我更新。
[Abstract]:Background : The presence of COX - 2 ( COX2 ) plays an important role in tumor recurrence and metastasis . In recent years , it has been found that COX2 and PGE2 play an important role in promoting the self - renewal of stem cells . In the study of gastric cancer , the effect of overexpression / interference FoxP3 on the expression of COX2 gene and protein expression level in colon cancer cells and other tumor cells was analyzed . The effect of overexpression / interference FoxP3 on the expression of COX2 gene and protein was analyzed by means of Real - Time PCR and Western Blot . The results showed that overexpression of FoxP3 could decrease the expression level of COX2 in CCSCs . The results showed that overexpression of FoxP3 could decrease the expression of COX2 in CCSCs . There is a negative correlation between the expression levels of CCSCs , which can significantly reduce the self and the ability of CCSCs .
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35
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本文編號：2104365