本文選題：骨肉瘤 + 長鏈非編碼RNA��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：目的分別檢測骨肉瘤組織與臨近非腫瘤組織,骨肉瘤患者血清和健康體檢人群血清長鏈非編碼RNA MALATl的表達水平,并對其表達水平和骨肉瘤患者的臨床特征之間的關(guān)系,在診斷,預后中的中的價值進行分析。在此基礎上,我們進一步檢測了MALAT1在骨肉瘤細胞系中的表達水平,并分析MALAT1在骨肉瘤細胞增殖,凋亡和遷移,侵襲中的作用及對鈣黏蛋白和miR-205的調(diào)控,從而揭示MALAT1在骨肉瘤疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法1.共收集66例骨肉瘤組織及臨近非腫瘤骨組織,45例骨肉瘤患者血清及30例正常體檢人群的血清樣本。運用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測MALAT1及其他相關(guān)分子的表達水平。2.通過繪制ROC曲線及術(shù)后跟蹤調(diào)查來對MALAT1在骨肉瘤患者中的診斷和預后價值進行分析。3.共使用U20S, MG63, SAOS-2和SOSP-9607四種骨肉瘤細胞系,和一種正常成骨細胞系hFOB作為對照。運RT-qPCR方法檢測上述細胞MALAT1及其他相關(guān)分子的表達水平。4.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法對上述細胞系進行MALAT1及其他相關(guān)分子高表達和沉默處理,處理之后進行后續(xù)的功能試驗或RNA和蛋白水平檢測。5.通過CCK8方法對骨肉瘤細胞系的增殖能力進行評估,通過流式凋亡細胞術(shù)對骨肉瘤細胞系的凋亡情況進行評估,通過運用transwell小室實驗對骨肉瘤細胞系的遷移侵襲能力進行檢測；運用RNA免疫共沉淀(RIP)和DNA免疫共沉淀(CMP)方法對MALAT1與EZH2, EZH2與鈣黏蛋白之間的交聯(lián)進行分析；運用western blot方法或免疫熒光方法對本研究中的蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果1.四種骨肉瘤細胞系U20S, MG63, SAOS-2和SOSP-9607的MALAT1表達水平顯著高于正常成骨細胞系hFOB的表達水平；66例骨肉瘤患者腫瘤組織的MALAT1表達水平顯著高于相鄰正常骨組織表達水平,而且58.8%的患者的MALAT1表達水平高于相鄰正常骨組織的表達的兩倍水平。臨床特征分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織的MALAT1表達水平與患者腫瘤侵襲(T),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠處轉(zhuǎn)移(M)顯著相關(guān)。三期和四期的骨肉瘤患者的表達水平顯著高于一期和二期患者。高表達MALAT1的臨床骨肉瘤患者其總體生存時間和無病生存時間顯著短于低表達的患者。2. RT-qPCR發(fā)現(xiàn)MALAT1和E-cadherin的mRNA表達水平在骨肉瘤組織中呈顯著負相關(guān)。Transwelll小室實驗提示MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力,并且能夠顯著降低E-cadherin蛋白的表達水平并促進Vimentin蛋白的表達。CCK8實驗發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細胞的增殖能力。3. RT-qPCR結(jié)果證明EZH2 mRNA表達水平在骨肉瘤組織中顯著升高,在骨肉瘤細胞系中也顯著升高,并且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MALAT1和EZH2表達水平呈顯著正相關(guān)。RIP實驗發(fā)現(xiàn)EZH2中MALAT1富集顯著,進一步分段RT-qPCR發(fā)現(xiàn)MALAT1的3’端與EZH2相交聯(lián)。4.EZH2能夠負向調(diào)控E-cadhein的表達,并且染色體免疫共沉淀實驗(ChIP)證實E-cadherin與EZH2相交聯(lián),從而抑制E-cadherin的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)MALAT1下調(diào)能夠顯著降低E-cadherin與EZH2的交聯(lián)作用,從而說明MALAT1通過與EZH2相結(jié)合作用的方式抑制E-cadherin的表達。并且功能試驗發(fā)現(xiàn)si-EZH2沉默EZH2之后能夠顯著逆轉(zhuǎn)MALAT1對細胞遷移侵襲能力及EMT能力的影響。5.通過miRcode生物信息學分析,我們證明了MALAT1與miR-205有結(jié)合區(qū)域,而且MALAT1和miR-205能夠相互抑制對方的表達水平,而且功能試驗發(fā)現(xiàn)miR-205能夠顯著抑制MALAT1引起的細胞增殖能力的提高。從而揭示了MALAT1對細胞增殖能力影響是通過miR-205起作用。結(jié)論MALAT1在骨肉瘤組織中高表達并且腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),高表達MALAT1的患者其生存能力顯著降低,說明MALAT1可作為骨肉瘤患者臨床預后的重要因子。相關(guān)功能試驗發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力,并能促進骨肉瘤細胞的增殖,這是通過與EZH2相關(guān)聯(lián)從而進一步降低E-cadherin的表達水平來實現(xiàn)的。最后,我們還發(fā)現(xiàn)MALAT1與miR-205相互抑制,miR-205能夠顯著逆轉(zhuǎn)MALAT1所導致的升高的增殖能力�？傊�,我們揭示了MALAT1作為一個長鏈非編碼RNA在骨肉瘤中的預后價值和潛在功能作用機制,為臨床提高骨肉瘤患者的治療和預后具有重要的價值,通過抑制MALAT1的表達可作為臨床骨肉瘤患者的治療和提高患者預后的有效方案。
[Abstract]:Objective To investigate the expression level of MALAT1 in osteosarcoma cell line by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) .
The cross - linking between MALAT and EZH2 , EZH2 and cadherin was analyzed by means of RNA immune coprecipitation ( RIP ) and DNA immunization co - precipitation ( CMP ) method .
The expression level of MALAT was significantly higher than that of normal osteoblast - line hFOB by western blot or immunofluorescence assay . Results 1 . The expression level of MALAT1 in four osteosarcoma cell lines U20, MG63 , SAOS - 2 and SOSP - 9607 was significantly higher than that of normal osteoblast - line hFOB .
The malAT1 expression level of 66 patients with osteosarcoma was significantly higher than that of adjacent normal bone tissues , and 58.8 % of patients with osteosarcoma were significantly higher than those of adjacent normal bone tissues . The clinical feature analysis found that the level of MALAT expression in osteosarcoma was significantly correlated with the invasion of tumor ( T ) , lymph node metastasis ( N ) and distant metastasis ( M ) . The expression level of MALAT and E - cadherin was negatively correlated with the expression of malAT1 and E - cadherin in osteosarcoma . Conclusion MALAT2 can significantly reduce the expression of MALAT and EZH2 . Conclusion MALAT1 can significantly reduce the expression level of MALAT and EZH2 , and it is shown that MALAT can significantly reduce the expression level of MALAT and EZH2 .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

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